JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, motor nöronların omurilik stimülasyonuna (SCS) elektriksel tepkilerini yüksek uzay-zamansal çözünürlükle incelemek için bir yama kelepçesi kullanan bir yöntemi açıklar ve bu da araştırmacıların omuriliği ayırma ve aynı anda hücre canlılığını sürdürme becerilerini geliştirmelerine yardımcı olabilir.

Özet

Omurilik stimülasyonu (SCS), omurilik yaralanması (SCI) sonrası lokomotor fonksiyonu etkili bir şekilde geri yükleyebilir. Motor nöronlar, sensorimotor davranışları yürüten son birim olduğundan, motor nöronların elektriksel tepkilerini SCS ile doğrudan incelemek, spinal motor modülasyonunun altında yatan mantığı anlamamıza yardımcı olabilir. Farklı uyaran özelliklerini ve hücresel tepkileri aynı anda kaydetmek için, bir yama kelepçesi, elektrofizyolojik özellikleri tek hücre ölçeğinde incelemek için iyi bir yöntemdir. Bununla birlikte, hücre canlılığını korumak, omuriliği kemikli yapıdan hızlı bir şekilde ayırmak ve aksiyon potansiyellerini başarılı bir şekilde indüklemek için SCS'yi kullanmak da dahil olmak üzere bu hedefe ulaşmada hala bazı karmaşık zorluklar vardır. Burada, motor nöronların yüksek uzay-zamansal çözünürlükle SCS'ye elektriksel tepkilerini incelemek için yama-kelepçe kullanarak ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, bu da araştırmacının omuriliği ayırma ve hücre canlılığını koruma becerilerini geliştirmelerine yardımcı olabilir.

Giriş

Omurilik stimülasyonu (SCS), omurilik yaralanması (SCI) sonrası lokomotor fonksiyonu etkili bir şekilde geri yükleyebilir. Andreas Rowald ve ark. SCS'nin tek bir gün içinde alt ekstremite lokomotor ve gövde fonksiyonunu sağladığını bildirmiştir1. Lokomotor geri kazanım için SCS'nin biyolojik mekanizmasını keşfetmek, daha kesin bir SCS stratejisi geliştirmek için kritik ve trend olan bir araştırma alanıdır. Örneğin, Grégoire Courtine'in ekibi, omurilikteki uyarıcı Vsx2 internöron ve Hoxa10 nöronlarının SCS'ye yanıt veren anahtar nöronlar olduğunu ve hücreye özgü nöromodülasyonun SCI2'den sonra sıçan yürüme yeteneğini geri kazanmak için mümkün olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, az sayıda çalışma, tek hücre ölçeğinde SCS'nin elektriksel mekanizmasına odaklanmaktadır. Klasik kalamar deneyi 3,4,5'te eşik üstü doğru akım uyaranının aksiyon potansiyellerini (AP'ler) ortaya çıkarabileceği iyi bilinmesine rağmen, SCS gibi darbeli alternatif elektriksel stimülasyonun motor sinyal üretimini nasıl etkilediği hala belirsizdir.

İntraspinal nöral devrelerin karmaşıklığı göz önüne alındığında, SKS'nin elektriksel mekanizmasının araştırılmasında hücre popülasyonu için uygun seçim önemlidir. SCS, propriyoseptif yol6'yı aktive ederek motor fonksiyonunu geri yüklese de, motor nöronlar, propriyosepsiyon bilgisi afferent girdisinin7 entegre edilmesinden türetilen motor komutu yürüten son birimdir. Bu nedenle, SCS ile motor nöronların elektriksel özelliklerini doğrudan incelemek, spinal motor modülasyonun altında yatan mantığı anlamamıza yardımcı olabilir.

Bildiğimiz gibi, yama kelepçesi, son derece yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip hücresel elektrofizyolojik kayıt için altın standart yöntemdir8. Bu nedenle, bu çalışma, motor nöronların SCS'ye elektriksel tepkilerini incelemek için bir yama kelepçesi kullanan bir yöntemi açıklamaktadır. Beyin yama kelepçesi9 ile karşılaştırıldığında, omurilik yama kelepçesi aşağıdaki nedenlerden dolayı daha zordur: (1) Omurilik, daha iyi hücre canlılığı elde etmek için çok ince mikromanipülasyon ve titiz buz gibi bakım gerektiren küçük hacimli vertebral kanal tarafından korunur. (2) Omurilik, kesme tepsisine sabitlenemeyecek kadar ince olduğundan, düşük erime noktalı agaroza daldırılmalı ve katılaşmadan sonra kesilmelidir.

Bu nedenle, bu yöntem, SCS'nin motor nöronlar üzerindeki elektriksel mekanizmasını sorunsuz bir şekilde incelemek ve gereksiz denemelerden ve hatalardan kaçınmak için omuriliğin diseke edilmesinde ve aynı zamanda hücre canlılığının korunmasında teknik ayrıntılar sağlar.

Protokol

Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tüm hayvan deneylerini onayladı ve çalışmalar ilgili hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak yürütüldü.

1. Hayvanların hazırlanması

  1. Hayvan
    1. Barınma bilgisi: Erkek Sprague-Dawley sıçanlarını (doğum sonrası 10-14 gün, P10-P14) belirli bir patojen içermeyen ortamda barındırın.
      NOT: Oda koşulları 20 °C ± 2 °C, nem: %50-60 arasında, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsüyle korunmuştur. Hayvanların yiyecek ve suya ücretsiz erişimi vardı.
    2. Motor nöronları retrograd olarak etiketleyin: Fedakarlıktan 2 gün önce motor nöronları retrograd olarak etiketlemek için bilateral tibialis anterior ve gastroknemius kasına (steril salinde% 2, kas başına 50 μL) Floro-Altın (FG) enjekte edin.
  2. Çözümleri
    1. Kesme çözeltisini hazırlayın: 120 mM Kolin Klorür, 2.6 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 0.5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1.3 mM Askorbik Asit, 15 mM Glikozu karıştırın. Çözeltiyi diseksiyon ve dilimlemeden önce 30 dakika boyunca %95 O2 ve %5CO2 (KOH ile pH 7.4'e ayarlayın) ile önceden köpürtün. Çözeltiyi kırılmış buzla soğutun.
    2. Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlayın: 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4'ü karıştırın; 1.3 mM MgCl 2, 2.4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ve 10 mM glikoz. Çözeltiyi inkübasyondan önce 30 dakika boyunca %95 O2 ve %5CO2 ile önceden köpürtün.
    3. Hücre içi çözelti hazırlayın: 126 mM K-Glukonat, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0.4 mM Na2GTP, 10 mM K-fosfokreatin ve% 0.5 Nörobiotin(pH 7.25 ve 305 mOsm / Kg). Çözeltiyi kırılmış buzla soğutun.
    4. Düşük erime noktalı agaroz jeli hazırlayın: 4 g agarozu 100 mL kesme çözeltisinde çözün ve tamamen çözmek için manyetik bir karıştırma rotoru kullanın. Gömmeden 30 dakika önce, düşük erime noktalı agarozu mikrodalga fırında yüksek güçte 1 dakika ısıtın ve ardından sıvı halini korumak için 39 °C'lik bir su banyosuna aktarın.
  3. Enstrüman hazırlığı
    1. Perfüzyondan 10 dakika önce kırılmış buzu perfüzyon tepsisine (Ek Şekil 1A) yerleştirin. Anatomik tepsiyi (Ek Şekil 1B) ve kesme tepsisini (Ek Şekil 1C) bir su bandı ile gece boyunca -80 °C'de yerleştirin.
    2. Naylon fileli inkübasyon odasını gece boyunca 45 °C'de fırına yerleştirin.
    3. 35°'lik bir eğimi ve 2 mm kalınlığında bir platformu prefabrike etmek için düşük erime noktalı agaroz kullanın (Ek Şekil 1D). Jel katılaşmasından sonra, sonraki prosedürlerde omuriliği desteklemek için bunları 35 mm'lik bir Petri kabının ortasına yerleştirin.
  4. İntrakardiyal perfüzyon
    1. Sıçanları intraperitoneal enjeksiyon yoluyla% 2.5 tribromoetanol (160 μL / 10 g) ile uyuşturun. Ayak parmağının hafifçe sıkışması gibi dış uyaranlara yanıt eksikliğini doğrulayarak sıçanların tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
    2. Uygun anestezi onaylandığında, sıçanları sırtüstü yatırın ve silika jel ile doldurulmuş Petri kabına hareketsiz hale getirin.
    3. Ksifoid işlemine kaudal olarak 5 mm'lik uzunlamasına bir cilt kesisi kesin, ardından deri altı boşluğunu tamamen genişletin. Dış göğüs duvarını tamamen ortaya çıkarmak için ventral orta hat boyunca 2 cm'lik uzunlamasına bir cilt kesisi kesin, yukarıda belirtilen kesiden başlayıp göğsün üst kısmı ile biter.
    4. Ksifoidi kaldırmak için dişli cımbız kullanın (Ek Şekil 2A) ve ardından diyaframı kesmek için ince makas kullanın. Göğsü açmak ve kalbi ortaya çıkarmak için sternumu ksifoid sürecin her iki tarafı boyunca kesin (Ek Şekil 2B).
      NOT: Her iki taraftaki iç torasik damarları korumaya dikkat edin; Aksi takdirde, büyük kanamaya neden olabilir.
    5. Sol ventrikülü kaldırmak için dişsiz cımbız kullanın. Sol ventrikülün uzunlamasına ekseni boyunca sol ventrikül apeksine 22 G'lik bir iğne yerleştirin (Ek Şekil 2C). Bu arada, perfüzyon tüpündeki ritmik kan nabzını gözlemleyin, aksi takdirde iğne sağ ventriküle delinebilir ve bu da zayıf bir perfüzyon etkisine yol açabilir.
      NOT: Dişli cımbız kullanılmamalıdır; Aksi takdirde cımbız tutma yerinden fazladan kan sızmasına neden olabilir.
    6. Sağ atriyumu kesmek için ince makas kullanın (Ek Şekil 2C), ardından 1 dakika içinde yaklaşık 2 mL/s hızında 100 mL buz gibi soğuk perfüzyon sıvısını manuel olarak enjekte edin.
      NOT: Sıçanların karaciğeri ve pençeleri soluklaştığında ve sağ atriyumdan kan akmadığında, iyi perfüzyon sağlanabilir.
  5. Omurilik diseyonu (Şekil 1)
    1. Sıçanı yüzüstü pozisyona getirin ve omurgayı sırasıyla anterior superior iliak omurgada (yaklaşık L4 vertebral seviyede) ve torasik kolonun eğrilik kayma noktasında (yaklaşık T6 vertebral seviyede) kesin (Şekil 1A). Ardından, kalan kan ve yağ dokusunu yıkamak için izole edilmiş omurgayı hemen oksijenli buz gibi perfüzyon solüsyonuna yerleştirin; Bu prosedür, sonraki prosedürlerde ameliyat alanını temiz tutmak için faydalıdır.
      NOT: Paraspinal kaslar, bir böcek pimi kullanılarak omurganın daha sonra sabitlenmesi için elverişli olan ayrılmalıdır.
    2. İzole omurgayı, dorsal tarafı yukarı ve rostral ucu operatöre yakın olacak şekilde hemen anatomik tepsiye (Şekil 1B) aktarın. Anatomik tepsiyi 50 mL sürekli oksijenli buz gibi kesme solüsyonu ile doldurun (Şekil 1B).
    3. Paraspinal kaslara nüfuz ederek omurgayı sabitlemek için dört böcek pimi kullanın (Şekil 1B).
    4. Diseksiyon mikroskobu altında her iki tarafın vertebral pedikülleri rostral uçtan mikro makas ile kesilerek "laminektomi" olarak adlandırılabilir (Şekil 1C). Omuriliğe zarar vermemeye dikkat edin. Bu arada, kesilen omur gövdesini kaldırmak için mikro dişli cımbız kullanın.
    5. Laminektomi sonrası omuriliği omurilik kanalından hemen ayırmayın. Bunun yerine, hücreler ve oksijenli ACSF arasında besin alımı için elverişli olan dorsal orta hat boyunca dura mater'i kesmek için bir mikro makas kullanın (Şekil 1D).
      NOT: Dura mater'i asla yırtmayın. Dura mater'in sadece mikro makasla kesilmesine izin verilir; Aksi takdirde, sinir kökü ve omurilik parankimi ciddi şekilde hasar görür!
    6. Omuriliğin rostral kısmını kaldırın, ardından sinir kökünü yaklaşık 1 mm ayrılmış olarak dikkatlice kesin (Şekil 1E). Omuriliği vertebral kanaldan ayırdıktan sonra, omuriliği ventral tarafı yukarı bakacak şekilde sabitlemek için 2 böcek pimi kullanın (Şekil 1F).
    7. Dura mater'i ventral orta hat boyunca kesmek için bir mikro makas kullanın (Şekil 1F). Gereksiz sinir köklerini yaklaşık 1 mm ayrılmış olarak kesin.
      NOT: Sinir, omurilikten çok daha inatçıdır. Ayrılmış sinir kökü çok uzunsa (>1 mm), vibratom sinir kökünü kesemez ve bu da spinal parankimde ciddi bir yırtılmaya neden olabilir.
    8. Bel genişlemesini 6-7 mm uzunluğa ayırmak için bir mikro makas kullanın (Şekil 1G).
  6. Düşük erime noktalı agaroz içine gömme
    1. Bel genişlemesini sırt tarafı yukarı ve kuyruk ucu aşağı gelecek şekilde 35 ° eğime (Şekil 1H) yerleştirin. Doku yüzeyindeki bol suyu çıkarmak için emici bir filtre kağıdı kullanın (Şekil 1H).
    2. Erimiş agaroz jeli, bel genişlemesini içeren Petri kabına yavaşça dökün (Şekil 1I).
      NOT: Çok hızlı dökmeyin, aksi takdirde jelde kabarcıklar birikir.
    3. Jeli mümkün olan en kısa sürede soğutmak için yukarıdaki Petri kabını buzlu su karışımına yerleştirin, bu da hücrelerin aktivitesini korumaya elverişlidir.
    4. Jeli 15 mm x 10 mm x 10 mm'lik bir küp halinde kesin ve süper yapıştırıcı ile numune diskine monte edin (Şekil 1J).
  7. Dilimleme
    1. Numune diskini önceden dondurulmuş kesme tepsisine yerleştirin, ardından buz gibi kesme solüsyonunu dökün (Şekil 1K). Kesme tepsisine sürekli olarak %95 CO2 ve %5O2 ile köpürtün.
    2. Vibratom parametrelerini ayarlayın: kalınlık: 350 μm; hız: 0.14-0.16 mm/s, genlik: 1.0 mm ve titreşim frekansı: 85 Hz.
    3. Hayvan başına 2-3 uygun dilim hasat edin. Hayvan başına 5-6 hücre aralığı ile dilim başına 1-2 sağlıklı FG+ motor nöron kaydedin.
  8. Kuluçka
    1. Bir dilimi kırpmak için kapak sürgülü cımbız kullanın (Şekil 1L) ve sürekli oksijenli ACSF ile dolu inkübasyon odasına yerleştirin. İnkübasyon odasını 30 dakika boyunca 32 °C'de bir su banyosuna yerleştirin ve ardından kayıttan önce 30 dakika daha oda sıcaklığında (RT) inkübe etmeye devam edin.
      NOT: Anesteziden ilk dilimin alınmasına kadar yukarıdaki prosedürler, hücrelerin canlılığını mümkün olduğunca korumak için 20-30 dakika içinde tamamlanmalıdır. Her dilimdeki motor nöronlar yaklaşık 6-7 saat canlılıklarını koruyabilirler.

2. SCS ile yama-kelepçe kaydı (Şekil 2)

  1. Hazırlık
    1. Kayıt odasını yaklaşık 1-2 mL/dk hızında sürekli kabarcıklı ACSF ile perfüze edin. Peristaltik pompa üzerindeki kontrol paneli aracılığıyla akış hızını ayrı ayrı ayarlayın.
    2. Kayıt odasına bir dilim yerleştirin. Dilimi yerinde sıkıca sabitlemek için naylon ipliklere sahip U şeklindeki platin teli kullanın.
    3. Dilimi gözlemlemek için bir kızılötesi diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (IR-DIC) kullanın. 4x objektif merceğin altında, sırt kökünün uzunluğunun yaklaşık 1 mm olduğunu onaylayın. Sırt kökünün parankimmaya girdiği alanı bulun, ardından merkezi görüş alanını bu bölgeye taşıyın.
    4. Darbe üretecini özel yapım elektrotlarla bağlayın (Şekil 2A).
  2. SCS yapılandırması
    1. SCS'nin anotunu mikromanipülasyon sistemi aracılığıyla dorsal orta hattın yakınına yerleştirin (Şekil 2B).
    2. SCS'nin katotunu mikromanipülasyon sistemi aracılığıyla dorsal kök giriş bölgesinin (DREZ) yakınına yerleştirin (Şekil 2B).
  3. Hücre hedefleme ve görüntüleme
    1. IR-DIC'yi 10x objektif lensle kabaca motor kolonun dorsolateral bölgesini bulun, çoğu motor nöronun bulunduğu yeri bulun. Ardından, merkezi görüş alanını bu alana taşıyın.
    2. Pürüzsüz ve parlak bir yüzeye ve görünmez çekirdeklere sahip sağlıklı bir nöron bulmak için 60x objektif merceğe geçin (Şekil 2C,F).
    3. IR yoğunluğunu hafifçe azaltın ve floresan ışık kaynağını açın. Uygun bir FG pozitif (FG+) motor nöron seçmek için ışık filtresini geniş bantlı ultraviyole uyarma filtresine (Şekil 2D, G) değiştirin (Şekil 2E, H).
    4. Dorsal köke 1x motor eşik stimülasyonu uygulamak için emme elektrotları kullanın. Motor nöronlarda uyarılmış bir aksiyon potansiyeli tespit edilirse (Ek Şekil 3), dorsal kökün aktivitesinin sağlam olduğunu doğrular. Değilse, bu dilim atılmalıdır.
  4. Yama kelepçesi kaydı
    1. Mikropipeti hücre içi solüsyonla doldurun ve elektrot tutucusuna yerleştirin. Pipeti ACSF banyosuna indirmek için mikromanipülasyon sistemini kullanın. Pipet direnci 5-8 MΩ arasında değişir.
    2. Tozu ve hücre kalıntılarını üflemek için pipete az miktarda pozitif basınç uygulayın.
      1. Hücreye yaklaşmak için elektrodu indirin. Pipet FG+ nöronun yüzeyine dokunduğunda, uç seviyesinde zarın küçük bir girintisi görünür hale gelir. Pozitif basıncı serbest bırakın.
      2. Ardından, bir şırınga kullanarak pipete az miktarda negatif basınç uygulayın. Bu, hücre zarını cam pipetle temas ettiren az miktarda emme oluşturur. Direnç değeri gigaohm'a (>1 GΩ) yükselene kadar her zaman yazılım arayüzündeki toplam dirence dikkat edin. Daha sonra gigaseal oluşturulur.
    3. Membran potansiyelini -70 mV'de sıkıştırın, ardından amplifikatörün yazılım arayüzündeki hızlı kapasitans dengeleme düğmesine basın. Hücre zarını yırtmak için yavaşça geçici olarak negatif bir basınç uygulayın, ardından amplifikatörün yazılım arayüzündeki yavaş kapasitans dengeleme düğmesine basın. Bu noktada, iyi bir tam hücre konfigürasyonu elde edilir.
    4. Yazılım arayüzündeki IC düğmesine tıklayarak akım kelepçesi moduna geçin ve dinlenme membran potansiyelini (RMP) kaydedin.
    5. SCS'yi 1-10 mA genlik ile 1-2 saniye boyunca uygulayın, darbe genişliği ve frekansı sırasıyla 210 μs ve 40 Hz'de sabitlenir. İlk AP gözlenene kadar stimülasyon genliğini yavaşça artırarak motor eşiği belirleyin.
    6. Akım kelepçesi modunda10,11,12 reobaz etrafına 5 s'lik bir depolarize akım enjeksiyonu kullanarak gecikmeli ve ani ateşleme motor nöronlarını ayırt edin. Anında ateşleme motor nöronları: Düşük reobaz, kararlı ateşleme frekansı ile anında ve tekrarlayan ateşlemeye neden olabilir; Gecikmeli ateşleme motor nöronları: Yüksek reobaz, hızlanan bir ateşleme hızı ile tekrarlayan ateşleme için gecikmeli bir başlangıca neden olabilir (Şekil 3).
    7. SCS kapatıldığında, kendiliğinden AP'lerin ateşlenmesini yakalamak için membran potansiyelini kaydetmeye devam edin.
    8. SCS açık ve kapalıyken uyarıcı postsinaptik akım (EPSC) için voltaj-kelepçe kayıtları voltaj-kelepçe kayıtları gerçekleştirin. Stimülasyon parametresi 1x motor eşik, 210 μs, 2 Hz'dir.

Sonuçlar

İnce işlem sırasında titiz düşük sıcaklık bakımı sayesinde (Ek Şekil 1, Ek Şekil 2 ve Şekil 1), hücre canlılığı sonraki elektrofizyolojik kayıtları gerçekleştirmek için yeterince iyiydi. Klinik senaryoyu mümkün olduğunca simüle etmek için, SCS katotunu ve anodu sırasıyla dorsal orta hat ve DREZ'in yakınına yerleştirmek için mikromanipülasyon kullandık (Şekil 2), bu da dorsal kornadaki nöral sinyali başlata...

Tartışmalar

SCS tarafından modüle edilen hareket bilgisi sonunda motor nöronlara yakınsar. Bu nedenle, motor nöronları araştırma hedefi olarak almak, çalışma tasarımını basitleştirebilir ve SKS'nin nöromodülasyon mekanizmasını daha doğrudan ortaya çıkarabilir. Farklı uyaran özelliklerini ve hücresel tepkileri aynı anda kaydetmek için, bir yama kelepçesi, elektrofizyolojik özellikleri tek hücre ölçeğinde incelemek için iyi bir yöntemdir. Bununla birlikte, hücre canlılığının nasıl korunacağı...

Açıklamalar

Hiç kimse

Teşekkürler

Bu çalışma, Genç Akademisyenler için Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (52207254 ve 82301657) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Fonu (2022M711833) tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium saltSigmaA9187
Ascorbic AcidSigmaA4034
CaCl2·2H2OSigmaC5080
Choline ChlorideSigmaC7527
Cover slide tweezersVETUS36A-SAClip a slice
D-GlucoseSigmaG8270
EGTASigmaE4378
Fine scissorsRWD Life ScienceS12006-10Cut the diaphragm
Fluorescence Light SourceOlympus U-HGLGPS
Fluoro-GoldFluorochromeFluorochromeLabel the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrateSigmaG8877
HEPESSigmaH3375
infrared CCD cameraDage-MTIIR-1000E
KClSigmaP5405
K-gluconateSigmaP1847
Low melting point agaroseSigmaA9414
MgSO4·7H2OSigmaM2773
Micromanipulator Sutter Instrument MP-200
Micropipette pullerSutter instrumentP1000
Micro-scissors Jinzhongwa1020Laminectomy
Microscope for anatomyOlympus SZX10
Microscope for ecletrophysiologyOlympus BX51WI
Micro-toothed tweezersRWD Life ScienceF11008-09Lift the cut vertebral body
NaClSigmaS5886
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaV900182
Na-PhosphocreatineSigmaP7936
Objective lens for ecletrophysiologyOlympus LUMPLFLN60XWworking distance 2 mm 
Osmometer Advanced FISKE 210
Patch-clamp amplifier Axon Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizerAxon Digidata 1550B
pH meter Mettler Toledo FE28
Slice AnchorMultichannel systemSHD-27H
Spinal cord stimulatiorPINST901
Toothed tweezerRWD Life ScienceF13030-10Lift the xiphoid
VibratomeLeicaVT1200S
Wide band ultraviolet excitation filterOlympus U-MF2

Referanslar

  1. Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
  2. Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
  3. Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
  4. Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
  5. Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
  6. Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
  7. Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  9. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
  10. Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
  11. Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
  12. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
  13. Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
  14. Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
  15. Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
  16. Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
  17. Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
  18. Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
  19. Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
  20. Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
  21. Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
  22. Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
  23. Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
  24. Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
  25. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  26. Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
  27. Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
  28. Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Ex VivoPreparatasyonOmurilik DilimiT m H cre Yama Klemp KaydMotor N ronlarOmurilik Stim lasyonuLokomotor FonksiyonOmurilik YaralanmasElektriksel TepkilerSensorimotor Davran larUyaran zellikleriH cresel Yan tlarPatch klemp Y ntemiElektrofizyolojik zelliklerH cre Canl lOmurilik Ayr lmasKemik Yap sAksiyon PotansiyelleriProtokolUzay zamansal z n rl kElektriksel Mekanizma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır