A Preparação Ex Vivo do Corte da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores Durante a Estimulação da Medula Espinhal

Resumo

Este protocolo descreve um método que utiliza um patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à estimulação da medula espinhal (SCS) com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar os pesquisadores a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular simultaneamente.

Resumo

A estimulação da medula espinhal (ECS) pode efetivamente restaurar a função locomotora após a lesão medular (LME). Como os neurônios motores são a unidade final para executar comportamentos sensório-motores, estudar diretamente as respostas elétricas dos neurônios motores com SCS pode nos ajudar a entender a lógica subjacente da modulação motora espinhal. Para registrar simultaneamente diversas características de estímulos e respostas celulares, um patch-clamp é um bom método para estudar as características eletrofisiológicas em escala unicelular. No entanto, ainda existem algumas dificuldades complexas para atingir esse objetivo, incluindo a manutenção da viabilidade celular, a separação rápida da medula espinhal da estrutura óssea e o uso do SCS para induzir com sucesso potenciais de ação. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado usando patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à SCS com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar o pesquisador a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular, ao mesmo tempo em que estuda suavemente o mecanismo elétrico da SCS no neurônio motor e evitar tentativas e erros desnecessários.

Introdução

A estimulação da medula espinhal (ECS) pode efetivamente restaurar a função locomotora após a lesão medular (LME). Andreas Rowald e col. relataram que a ECS possibilita a função locomotora e do tronco dos membros inferiores em um único dia¹. Explorar o mecanismo biológico da SCS para recuperação locomotora é um campo de pesquisa crítico e de tendência para o desenvolvimento de uma estratégia SCS mais precisa. Por exemplo, a equipe de Grégoire Courtine demonstrou que o interneurônio excitatório Vsx2 e os neurônios Hoxa10 na medula espinhal são os neurônios-chave para responder à SCS, e a neuromodulação célula-específica é viável para restaurar a capacidade de andar do rato após a LME². No entanto, poucos estudos enfocam o mecanismo elétrico da SCS em escala unicelular. Embora seja bem conhecido que o estímulo de corrente contínua supralimiar pode eliciar os potenciais de ação (PAs) no experimento clássico com lulas ^3,4,5, ainda não está claro como a estimulação elétrica alternada pulsada, como a ECS^, afeta a geração do sinal motor.

Dada a complexidade dos circuitos neurais intraespinhais, a seleção apropriada para a população celular é importante para investigar o mecanismo elétrico da SCS. Embora o ECS restaure a função motora ativando a via proprioceptiva⁶, os neurônios motores são a unidade final para executar o comando motor, derivado da integração da entrada aferente de informações proprioceptivas⁷. Portanto, estudar diretamente as características elétricas dos neurônios motores com SCS pode nos ajudar a entender a lógica subjacente da modulação motora espinhal.

Como sabemos, patch-clamp é o método padrão-ouro para registro eletrofisiológico celular com resolução espaço-temporal extremamente^alta8. Portanto, este estudo descreve um método que utiliza um patch clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à SCS. Comparado com o patch-clamp⁹ do cérebro, o patch-clamp da medula espinhal é mais difícil devido aos seguintes motivos: (1) A medula espinhal é protegida pelo canal vertebral com volume minúsculo, o que requer micromanipulação muito fina e manutenção rigorosa do gelo para obter melhor viabilidade celular. (2) Como a medula espinhal é muito fina para ser fixada na bandeja de corte, ela deve ser imersa em agarose de baixo ponto de fusão e aparada após a solidificação.

Assim, este método fornece detalhes técnicos na dissecção da medula espinhal e na manutenção da viabilidade celular ao mesmo tempo, de modo a estudar suavemente o mecanismo elétrico da SCS em neurônios motores e evitar tentativas e erros desnecessários.

Protocolo

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou todos os experimentos com animais e os estudos foram conduzidos de acordo com as normas pertinentes de bem-estar animal.

1. Preparação dos animais

1. Animais
   1. Informações sobre alojamento: Ratos Sprague-Dawley machos domésticos (10-14 dias pós-natal, P10-P14) em um ambiente específico livre de patógenos.
      NOTA: As condições da sala foram mantidas em 20 °C ± 2 °C, umidade: 50%-60%, com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Os animais tinham livre acesso a comida e água.
   2. Rotular os neurônios motores retrogradamente: Injetar Fluoro-Gold (FG) no músculo tibial anterior e gastrocnêmio bilateral (2% em solução salina estéril, 50 μL por músculo) para marcar retrogradamente os neurônios motores 2 dias antes do sacrifício.
2. Soluções
   1. Preparar solução de corte: Misture 120 mM de cloreto de colina, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO₄, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl₂, _1,3 mM ácido ascórbico, 15 mM glicose. Pré-borbulhar a solução com 95% de O 2 e 5% de CO₂ (ajustar para pH 7,4 com KOH) por 30 min antes da dissecção e fatiamento. Arrefecer a solução com gelo picado.
   2. Preparar líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF): Misturar 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH₂PO4; 1,3 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃ e 10 mM glicose. Pré-borbulhar a solução com 95% de O 2 e 5% de CO₂ por 30 min antes da incubação.
   3. Preparar solução intracelular: Misturar 126 mM K-Gluconato, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na₂GTP, 10 mM K-Fosfocreatina e 0,5% Neurobiotina (pH 7,25 e 305 mOsm/Kg). Arrefecer a solução com gelo picado.
   4. Prepare o gel de agarose de baixo derretimento: Dissolva 4 g de agarose em 100 mL de solução de corte e use um rotor de agitação magnética para dissolvê-lo completamente. A 30 minutos antes de incorporar, aqueça a agarose de baixo ponto de fusão no forno de micro-ondas com alta potência por 1 min e, em seguida, transfira-a para um banho-maria de 39 °C para manter o estado líquido.
3. Preparação do instrumento
   1. Colocar gelo triturado na bandeja de perfusão (Figura 1A suplementar) 10 minutos antes da perfusão. Coloque a bandeja anatômica (Figura 1B Suplementar) e a bandeja de corte (Figura 1C Suplementar) com uma faixa de água a -80 °C com antecedência.
   2. Colocar a câmara de incubação com tela de nylon no forno a 45 °C durante a noite com antecedência.
   3. Use agarose de baixo ponto de fusão para pré-fabricar uma inclinação de 35° e uma plataforma de 2 mm de espessura (Figura 1D suplementar). Após a solidificação do gel, coloque-os no centro de uma placa de Petri de 35 mm para apoiar a medula espinhal nos próximos procedimentos.
4. Perfusão intracárdica
   1. Anestesiar os ratos com tribromoetanol a 2,5% (160 μL/10 g) por injeção intraperitoneal. Certifique-se de que os ratos estão totalmente anestesiados, verificando a falta de resposta a estímulos externos, como uma leve pitada do dedo do pé.
   2. Confirmada a anestesia adequada, colocar os ratos em decúbito dorsal e imobilizá-los na placa de Petri preenchida com sílica gel.
   3. Cortar uma incisão longitudinal de 5 mm na pele caudalmente ao processo xifoide e, em seguida, expandir completamente o espaço subcutâneo. Cortar uma incisão cutânea longitudinal de 2 cm ao longo da linha média ventral para expor completamente a parede torácica externa, começando com a incisão acima mencionada e terminando com o topo do tórax.
   4. Use uma pinça dentada para levantar o xifoide (Figura 2A Suplementar) e, em seguida, use uma tesoura fina para cortar o diafragma. Cortar o esterno em ambos os lados do processo xifoide para abrir o tórax e expor o coração (Figura 2B suplementar).
      OBS: Cuidado para preservar os vasos torácicos internos de ambos os lados; caso contrário, pode causar sangramento maciço.
   5. Use pinça desdentada para levantar o ventrículo esquerdo. Inserir uma agulha 22G no ápice do ventrículo esquerdo ao longo do eixo longitudinal do ventrículo esquerdo (Figura 2C suplementar). Enquanto isso, observe a pulsação rítmica do sangue no tubo de perfusão, ou a agulha pode perfurar o ventrículo direito, o que pode levar a um efeito de perfusão pobre.
      OBS: Pinça dentada não deve ser usada; caso contrário, pode causar vazamento de sangue extra do local de retenção da pinça.
   6. Use uma tesoura fina para cortar o átrio direito (Figura 2C suplementar) e, em seguida, injete manualmente 100 mL de líquido de perfusão gelado a uma taxa de cerca de 2 mL/s em 1 minuto.
      NOTA: Quando o fígado e as patas dos ratos ficam pálidos e não há sangue saindo do átrio direito, uma boa perfusão pode ser obtida.
5. Dissecção medular (Figura 1)
   1. Coloque o rato em decúbito ventral e corte a coluna vertebral na espinha ilíaca anterossuperior (cerca do nível vertebral de L4) e no ponto de deslocamento da curvatura da coluna torácica (aproximadamente ao nível vertebral de T6), respectivamente (Figura 1A). Em seguida, coloque imediatamente a coluna isolada na solução de perfusão gelada oxigenada para lavar o sangue residual e o tecido adiposo; Esse procedimento é benéfico para manter o campo operatório limpo nos procedimentos subsequentes.
      NOTA: Os músculos paraespinhais devem ser reservados, o que é propício para a posterior fixação da coluna vertebral usando um pino de inseto.
   2. Transfira imediatamente a coluna isolada para a bandeja anatômica (Figura 1B) com o dorso para cima e a extremidade rostral próxima ao operador. Preencher a moldeira anatômica com 50 mL de solução de corte continuamente oxigenada e gelada (Figura 1B).
   3. Use quatro pinos de insetos para fixar a coluna penetrando nos músculos paraespinhais (Figura 1B).
   4. Ao microscópio de dissecção, cortar os pedículos vertebrais de ambos os lados da extremidade rostral com a microtesoura, que pode ser denominada "laminectomia" (Figura 1C). Preste atenção para não danificar a medula espinhal. Enquanto isso, use a pinça microdentada para levantar o corpo vertebral cortado.
   5. Após a laminectomia, não separe a medula espinhal do canal espinhal imediatamente. Em vez disso, use uma microtesoura para cortar a dura-máter ao longo da linha média dorsal, o que é propício para a captação de nutrientes entre as células e ACSF oxigenada (Figura 1D).
      NOTA: Nunca rasgue a dura-máter. Só é permitido o corte da dura-máter por microtesoura; caso contrário, a raiz nervosa e o parênquima espinhal serão seriamente danificados!
   6. Levantar a parte rostral da medula espinhal e, em seguida, cortar cuidadosamente a raiz nervosa com cerca de 1 mm reservado (Figura 1E). Após separar a medula espinhal do canal vertebral, utilizar 2 pinos de insetos para fixar a medula espinhal com o lado ventral para cima (Figura 1F).
   7. Utilizar uma microtesoura para cortar a dura-máter ao longo da linha média ventral (Figura 1F). Cortar as raízes nervosas redundantes com cerca de 1 mm reservado.
      NOTA: O nervo é muito mais tenaz do que a medula espinhal. Se a raiz nervosa reservada for muito longa (>1 mm), o vibratome não pode cortar a raiz nervosa, o que pode levar a uma ruptura grave no parênquima espinhal.
   8. Utilizar uma microtesoura para separar o alargamento lombar até um comprimento de 6-7 mm (Figura 1G).
6. Incorporação na agarose de baixo derretimento
   1. Colocar o alargamento lombar na inclinação de 35° (Figura 1H) com a face dorsal para cima e a extremidade caudal para baixo. Use um papel de filtro absorvente para remover água abundante na superfície do tecido (Figura 1H).
   2. Despeje lentamente o gel de agarose derretido na placa de Petri contendo o aumento lombar (Figura 1I).
      NOTA: Não despeje muito rápido, ou bolhas se acumularão no gel.
   3. Coloque a placa de Petri acima na mistura de água gelada para resfriar o gel o mais rápido possível, o que é propício para manter a atividade das células.
   4. Aparar o gel em um cubo de 15 mm x 10 mm x 10 mm e montá-lo no disco da amostra com supercola (Figura 1J).
7. Cortar
   1. Coloque o disco da amostra na bandeja de corte pré-congelada e, em seguida, despeje a solução de corte gelada (Figura 1K). Borbulhar continuamente com 95% CO 2 e 5% O₂ na bandeja de corte.
   2. Defina os parâmetros do vibratom: espessura: 350 μm; velocidade: 0,14-0,16 mm/s, amplitude: 1,0 mm e frequência de vibração: 85 Hz.
   3. Colha 2-3 fatias adequadas por animal. Registre 1-2 neurônios motores FG+ saudáveis por fatia, com uma faixa de 5-6 células por animal.
8. Incubação
   1. Use uma pinça deslizante para prender um corte (Figura 1L) e colocá-lo na câmara de incubação preenchida com ACSF continuamente oxigenada. Colocar a câmara de incubação em banho-maria a 32 °C durante 30 minutos e, em seguida, continuar a incubá-la à temperatura ambiente (TR) durante mais 30 minutos antes do registo.
      NOTA: Os procedimentos acima, desde a anestesia até a obtenção do primeiro corte, devem ser concluídos dentro de 20-30 min para manter a viabilidade das células tanto quanto possível. Os neurônios motores em cada fatia podem manter sua viabilidade por aproximadamente 6-7 h.

2. Gravação de patch clamp com SCS (Figura 2)

1. Preparações
   1. Perfundir a câmara de gravação com ACSF continuamente borbulhada a uma taxa de cerca de 1-2 mL/min. Ajuste a vazão individualmente através do painel de controle da bomba peristáltica.
   2. Coloque uma fatia na câmara de gravação. Use o fio de platina em forma de U com fios de nylon para estabilizar firmemente a fatia no lugar.
   3. Use um microscópio de contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) para observar o corte. Sob a lente objetiva 4x, confirme se o comprimento da raiz dorsal é de cerca de 1 mm. Encontre a área onde a raiz dorsal entra no parênquima e, em seguida, mova o campo de visão central para esta área.
   4. Conecte o gerador de pulsos com eletrodos feitos sob medida (Figura 2A).
2. Configuração do SCS
   1. Colocar o ânodo do SCS próximo à linha média dorsal através do sistema de micromanipulação (Figura 2B).
   2. Colocar o cátodo do SCS próximo à zona de entrada da raiz dorsal (DREZ) através do sistema de micromanipulação (Figura 2B).
3. Segmentação e geração de imagens de células
   1. Use IR-DIC com uma lente objetiva de 10x encontrar aproximadamente a região dorsolateral da coluna motora, onde a maioria dos neurônios motores estão localizados. Em seguida, mova o campo de visão central para esta área.
   2. Mude para uma lente objetiva de 60x para encontrar um neurônio saudável com uma superfície lisa e brilhante e núcleos invisíveis (Figura 2C,F).
   3. Diminua ligeiramente a intensidade do infravermelho e ligue a fonte de luz de fluorescência. Alternar o filtro de luz para o filtro de excitação ultravioleta de banda larga (Figura 2D,G), para selecionar um neurônio motor FG-positivo (FG+) apropriado (Figura 2E,H).
   4. Use eletrodos de sucção para aplicar estimulação do limiar motor de 1x na raiz dorsal. Se um potencial de ação evocado é detectado nos neurônios motores (Figura 3 Suplementar), confirma-se que a atividade da raiz dorsal está intacta. Caso contrário, essa fatia deve ser descartada.
4. Gravação de patch-clamp
   1. Encha a micropipeta com a solução intracelular e insira-a no suporte do eléctrodo. Use o sistema de micromanipulação para abaixar a pipeta para o banho de ACSF. A resistência da pipeta varia de 5-8 MΩ.
   2. Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta para soprar a poeira e os detritos celulares.
      1. Abaixe o eletrodo para se aproximar da célula. Quando a pipeta toca a superfície do neurônio FG+, um pequeno recuo da membrana torna-se visível ao nível da ponta. Solte a pressão positiva.
      2. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de pressão negativa na pipeta usando uma seringa. Isso cria uma pequena quantidade de sucção que puxa a membrana celular em contato com a pipeta de vidro. Sempre preste atenção à resistência total na interface do software até que o valor da resistência aumente para gigaohms (>1 GΩ). Em seguida, o gigaseal é formado.
   3. Aperte o potencial de membrana a -70 mV e, em seguida, pressione o botão de compensação rápida de capacitância na interface de software do amplificador. Aplique suavemente uma pressão negativa transitória para romper a membrana celular e, em seguida, pressione o botão de compensação de capacitância lenta na interface de software do amplificador. Neste ponto, uma boa configuração de célula inteira é obtida.
   4. Alterne para o modo de fixação de corrente clicando no botão IC na interface do software e registre o potencial de membrana de repouso (RMP).
   5. Aplicar o SCS por 1-2 s com amplitude de 1-10 mA, enquanto a largura e a frequência de pulso são fixadas em 210 μs e 40 Hz, respectivamente. Determinar o limiar motor aumentando lentamente a amplitude de estimulação até que a primeira PA seja observada.
   6. Distinguir neurônios motores de disparo retardado e imediato usando uma injeção de corrente despolarizante de 5 s ao redor da reobase no modo de pinça de corrente^10,11,12. Neurônios motores de disparo imediato: A baixa reobase pode induzir disparos imediatos e repetitivos com frequência de disparo estável; Neurônios motores de disparo tardios: A reobase alta pode induzir um início tardio para disparos repetitivos com uma taxa de disparo acelerada (Figura 3).
   7. Quando o SCS estiver desligado, continue a registrar o potencial de membrana para capturar os APs disparando espontaneamente.
   8. Execute gravações de clamp de voltagem para corrente pós-sináptica excitatória (EPSC) quando o SCS estiver ligado e desligado. O parâmetro de estimulação é 1x limiar motor, 210 μs, 2 Hz.

Resultados

Graças à rigorosa manutenção a baixa temperatura durante a operação fina (Figura 1 Suplementar, Figura 2 Suplementar e Figura 1), a viabilidade celular foi boa o suficiente para realizar registros eletrofisiológicos subsequentes. Para simular ao máximo o cenário clínico, utilizamos a micromanipulação para posicionar o cátodo e o ânodo do SCS próximos à linha média dorsal e ao EDRED, respectivamente (Figura 2), o que poderia inic...

Discussão

A informação do movimento modulada pela SCS é finalmente convergente para os neurônios motores. Portanto, tomar os neurônios motores como alvo da pesquisa pode simplificar o desenho do estudo e revelar o mecanismo de neuromodulação da SCS mais diretamente. Para registrar simultaneamente diversas características de estímulos e respostas celulares, um patch-clamp é um bom método para estudar as características eletrofisiológicas em escala unicelular. No entanto, ainda existem algumas dificuldades, incluindo co...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
Choline Chloride	Sigma	C7527
Cover slide tweezers	VETUS	36A-SA	Clip a slice
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Fine scissors	RWD Life Science	S12006-10	Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
infrared CCD camera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconate	Sigma	P1847
Low melting point agarose	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Micropipette puller	Sutter instrument	P1000
Micro-scissors	Jinzhong	wa1020	Laminectomy
Microscope for anatomy	Olympus	SZX10
Microscope for ecletrophysiology	Olympus	BX51WI
Micro-toothed tweezers	RWD Life Science	F11008-09	Lift the cut vertebral body
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphocreatine	Sigma	P7936
Objective lens for ecletrophysiology	Olympus	LUMPLFLN60XW	working distance 2 mm
Osmometer	Advanced	FISKE 210
Patch-clamp amplifier	Axon	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Digidata 1550B
pH meter	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Multichannel system	SHD-27H
Spinal cord stimulatior	PINS	T901
Toothed tweezer	RWD Life Science	F13030-10	Lift the xiphoid
Vibratome	Leica	VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter	Olympus	U-MF2