La preparación ex vivo del corte de la médula espinal para el registro de patch-clamp de células enteras en neuronas motoras durante la estimulación de la médula espinal

Resumen

Este protocolo describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras a la estimulación de la médula espinal (SCS) con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular simultáneamente.

Resumen

La estimulación de la médula espinal (SCS, por sus siglas en inglés) puede restaurar eficazmente la función locomotora después de una lesión de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés). Debido a que las neuronas motoras son la unidad final para ejecutar los comportamientos sensoriomotores, el estudio directo de las respuestas eléctricas de las neuronas motoras con SCS puede ayudarnos a comprender la lógica subyacente de la modulación motora espinal. Para registrar simultáneamente diversas características de estímulos y respuestas celulares, un patch-clamp es un buen método para estudiar las características electrofisiológicas a escala de una sola célula. Sin embargo, todavía existen algunas dificultades complejas para lograr este objetivo, incluido el mantenimiento de la viabilidad celular, la separación rápida de la médula espinal de la estructura ósea y el uso del SCS para inducir con éxito potenciales de acción. Aquí, presentamos un protocolo detallado que utiliza patch-clamp para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras al SCS con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular al mismo tiempo para estudiar sin problemas el mecanismo eléctrico del SCS en la neurona motora y evitar pruebas y errores innecesarios.

Introducción

La estimulación de la médula espinal (SCS, por sus siglas en inglés) puede restaurar eficazmente la función locomotora después de una lesión de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés). Andreas Rowald et al. informaron que el SCS permite la función locomotora y troncal de las extremidades inferiores en un solo día¹. La exploración del mecanismo biológico del SCS para la recuperación locomotora es un campo de investigación crítico y de tendencia para desarrollar una estrategia de SCS más precisa. Por ejemplo, el equipo de Grégoire Courtine demostró que la interneurona excitadora Vsx2 y las neuronas Hoxa10 en la médula espinal son las ne....

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales aprobó todos los experimentos con animales y los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con las normas pertinentes de bienestar animal.

1. Preparación de los animales

1. Animales
   1. Información sobre el alojamiento: Aloje ratas macho Sprague-Dawley (Postnatal 10-14 días, P10-P14) en un ambiente específico libre de patógenos.
      NOTA: Las condiciones de la habitación se mantuvieron a 20 °C ± 2 °C, humedad: 50%-60%, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los animales tenían libre acceso a comida y agua.
   2. Etiquetar las neuronas motoras retrógradamente: I....

Discusión

La información de movimiento modulada por el SCS finalmente converge a las neuronas motoras. Por lo tanto, tomar las neuronas motoras como objetivo de investigación puede simplificar el diseño del estudio y revelar el mecanismo de neuromodulación del SCS de manera más directa. Para registrar simultáneamente diversas características de estímulos y respuestas celulares, un patch-clamp es un buen método para estudiar las características electrofisiológicas a escala de una sola célula. Sin embargo, todavía exist.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
Choline Chloride	Sigma	C7527
Cover slide tweezers	VETUS	36A-SA	Clip a slice
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Fine scissors	RWD Life Science	S12006-10	Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
infrared CCD camera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconate	Sigma	P1847
Low melting point agarose	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Micropipette puller	Sutter instrument	P1000
Micro-scissors	Jinzhong	wa1020	Laminectomy
Microscope for anatomy	Olympus	SZX10
Microscope for ecletrophysiology	Olympus	BX51WI
Micro-toothed tweezers	RWD Life Science	F11008-09	Lift the cut vertebral body
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphocreatine	Sigma	P7936
Objective lens for ecletrophysiology	Olympus	LUMPLFLN60XW	working distance 2 mm
Osmometer	Advanced	FISKE 210
Patch-clamp amplifier	Axon	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Digidata 1550B
pH meter	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Multichannel system	SHD-27H
Spinal cord stimulatior	PINS	T901
Toothed tweezer	RWD Life Science	F13030-10	Lift the xiphoid
Vibratome	Leica	VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter	Olympus	U-MF2