طرق التثقيب الكهربائي وتأكيد التحول في Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولات للعمل مع Limosilactobacillus reuteri DSM20016 ، مع تفصيل النمو ، وتحويل البلازميد ، ومستعمرة PCR ، وقياس بروتين مراسل الفلورسنت ، وإعداد البلازميد المصغر المحدود ، بالإضافة إلى المشكلات الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. تسمح هذه البروتوكولات بقياس بروتينات المراسل في DSM20016 ، أو التأكيد عبر مستعمرة PCR إذا لم يكن هناك مراسل.

Abstract

كانت Lactobacillus جنسا كبيرا ومتنوعا بشكل لا يصدق من البكتيريا يضم 261 نوعا ، كان العديد منها سلالات متعايشة مع إمكانية استخدامها كهيكل للمساعي البيولوجية الاصطناعية داخل الجهاز الهضمي. أدى الاختلاف الواسع في النمط الظاهري والنمط الجيني الذي لوحظ داخل الجنس إلى إعادة تصنيف حديثة وإدخال 23 جنسا جديدا.

نظرا لاتساع نطاق الاختلافات داخل الأجناس القديمة ، قد لا تعمل البروتوكولات الموضحة في أحد الأعضاء كما هو معلن مع الأعضاء الآخرين. أدى نقص المعلومات المركزية حول كيفية التعامل بالضبط مع سلالات معينة إلى مجموعة من الأساليب المخصصة ، والتي غالبا ما يتم تكييفها من عائلات بكتيرية أخرى. هذا يمكن أن يعقد الأمور بالنسبة للباحثين الذين يبدأون في هذا المجال ، والذين قد لا يعرفون المعلومات التي تنطبق أو لا تنطبق على السلالة التي اختاروها.

في هذه الورقة ، نهدف إلى مركزية مجموعة من البروتوكولات ذات النجاح الواضح ، وتحديدا في تسمية سلالة Limosilactobacillus reuteri F275 (أرقام المجموعة الأخرى: DSM20016 ، ATCC23272 ، CIP109823) ، جنبا إلى جنب مع نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمشكلات الشائعة التي قد يواجهها المرء. يجب أن تمكن هذه البروتوكولات الباحث الذي لديه خبرة قليلة أو معدومة في العمل مع L. reuteri DSM20016 تحويل البلازميد ، وتأكيد التحول ، وقياس ردود فعل النظام في قارئ لوحة عبر بروتين مراسل.

Introduction

تم تصنيف جنس Lactobacillus تاريخيا على أنه إيجابي الجرام ، على شكل قضيب ، غير مكون للجراثيم ، إما لاهوائيات اختيارية أو محبة للميكروات تكسر السكريات لإنتاج حمض اللاكتيك¹ بشكل أساسي. أدت هذه المعايير الفضفاضة إلى كون Lactobacillus ، ظاهريا ووراثيا ، جنسا متنوعا للغاية. أدى هذا التصنيف الواسع إلى إعادة تصنيف الجنس ، حيث قدم 23 جنسا جديدا في عام 2020².

شمل الجنس القديم الأوسع أنواعا رئيسية من البروبيوتيك تعتبر عموما آمنة (GRAS) للاستهلاك³. تحافظ عائلة Lactobacillaceae على تصور عام بأنها "بكتيريا جيدة" بسبب العديد من الفوائد الصحية المبلغ عنها الم....

Protocol

1. تحضير L. reuteri DSM20016 الخلايا الكهربائية

ملاحظة: يستند هذا إلى بروتوكول أعده Berthier et ^al.17 ، مع سرعات الطرد المركزي التي أبلغ بها Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، قم بتلقيح L. reuteri من مخزون الجلسرين إلى 6 مل من مرق deMan Rogosa Sharpe (MRS). احتضان هوائي بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة.
2. في صباح اليوم التالي ، قم بتلقيح 4 مل من الثقافة الليلية في 200 مل من مرق MRS (1:50 تخفيف).
3. السماح بالنمو هوائيا في حاضنة ثابتة 37 درجة مئوية حتى تصل قيمة الكثافة البصرية 600 نانو....

النتائج

كفاءات التحول
لا يتطلب L. reuteri بلازميد dcm- / dam^- غير ميثيلي ، كما لوحظ بالنسبة ل Lactobacillaceae^19،20 الأخرى (انظر الشكل 1). يجب أن يعطي التثقيب الكهربائي ل L. reuteri DSM20016 مع 10 ميكرولتر من pTRKH3_mCherry2 البلازميد 8.5 كيلو بايت (أص.......

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية لتحويل L. reuteri DSM20016 هي توليد ظروف النمو اللاهوائي بعد التحولات المطلية. المستعمرات المكتسبة في الظروف الهوائية هي فقط عرضية جدا وتفشل عموما في النمو عند تلقيحها في مرق MRS. يجب أيضا ممارسة طلاء حجم الاسترداد بالكامل لزيادة احتمالية نمو المستعمرة. حتى مع هاتين الخطوت?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production