A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولات للعمل مع Limosilactobacillus reuteri DSM20016 ، مع تفصيل النمو ، وتحويل البلازميد ، ومستعمرة PCR ، وقياس بروتين مراسل الفلورسنت ، وإعداد البلازميد المصغر المحدود ، بالإضافة إلى المشكلات الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. تسمح هذه البروتوكولات بقياس بروتينات المراسل في DSM20016 ، أو التأكيد عبر مستعمرة PCR إذا لم يكن هناك مراسل.

Abstract

كانت Lactobacillus جنسا كبيرا ومتنوعا بشكل لا يصدق من البكتيريا يضم 261 نوعا ، كان العديد منها سلالات متعايشة مع إمكانية استخدامها كهيكل للمساعي البيولوجية الاصطناعية داخل الجهاز الهضمي. أدى الاختلاف الواسع في النمط الظاهري والنمط الجيني الذي لوحظ داخل الجنس إلى إعادة تصنيف حديثة وإدخال 23 جنسا جديدا.

نظرا لاتساع نطاق الاختلافات داخل الأجناس القديمة ، قد لا تعمل البروتوكولات الموضحة في أحد الأعضاء كما هو معلن مع الأعضاء الآخرين. أدى نقص المعلومات المركزية حول كيفية التعامل بالضبط مع سلالات معينة إلى مجموعة من الأساليب المخصصة ، والتي غالبا ما يتم تكييفها من عائلات بكتيرية أخرى. هذا يمكن أن يعقد الأمور بالنسبة للباحثين الذين يبدأون في هذا المجال ، والذين قد لا يعرفون المعلومات التي تنطبق أو لا تنطبق على السلالة التي اختاروها.

في هذه الورقة ، نهدف إلى مركزية مجموعة من البروتوكولات ذات النجاح الواضح ، وتحديدا في تسمية سلالة Limosilactobacillus reuteri F275 (أرقام المجموعة الأخرى: DSM20016 ، ATCC23272 ، CIP109823) ، جنبا إلى جنب مع نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمشكلات الشائعة التي قد يواجهها المرء. يجب أن تمكن هذه البروتوكولات الباحث الذي لديه خبرة قليلة أو معدومة في العمل مع L. reuteri DSM20016 تحويل البلازميد ، وتأكيد التحول ، وقياس ردود فعل النظام في قارئ لوحة عبر بروتين مراسل.

Introduction

تم تصنيف جنس Lactobacillus تاريخيا على أنه إيجابي الجرام ، على شكل قضيب ، غير مكون للجراثيم ، إما لاهوائيات اختيارية أو محبة للميكروات تكسر السكريات لإنتاج حمض اللاكتيك1 بشكل أساسي. أدت هذه المعايير الفضفاضة إلى كون Lactobacillus ، ظاهريا ووراثيا ، جنسا متنوعا للغاية. أدى هذا التصنيف الواسع إلى إعادة تصنيف الجنس ، حيث قدم 23 جنسا جديدا في عام 20202.

شمل الجنس القديم الأوسع أنواعا رئيسية من البروبيوتيك تعتبر عموما آمنة (GRAS) للاستهلاك3. تحافظ عائلة Lactobacillaceae على تصور عام بأنها "بكتيريا جيدة" بسبب العديد من الفوائد الصحية المبلغ عنها الم....

Protocol

1. تحضير L. reuteri DSM20016 الخلايا الكهربائية

ملاحظة: يستند هذا إلى بروتوكول أعده Berthier et al.17 ، مع سرعات الطرد المركزي التي أبلغ بها Rattanachaikunsopon et al.18.

  1. في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، قم بتلقيح L. reuteri من مخزون الجلسرين إلى 6 مل من مرق deMan Rogosa Sharpe (MRS). احتضان هوائي بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة.
  2. في صباح اليوم التالي ، قم بتلقيح 4 مل من الثقافة الليلية في 200 مل من مرق MRS (1:50 تخفيف).
  3. السماح بالنمو هوائيا في حاضنة ثابتة 37 درجة مئوية حتى تصل قيمة الكثافة البصرية 600 نانو....

النتائج

كفاءات التحول
لا يتطلب L. reuteri بلازميد dcm- / dam- غير ميثيلي ، كما لوحظ بالنسبة ل Lactobacillaceae19،20 الأخرى (انظر الشكل 1). يجب أن يعطي التثقيب الكهربائي ل L. reuteri DSM20016 مع 10 ميكرولتر من pTRKH3_mCherry2 البلازميد 8.5 كيلو بايت (أص.......

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية لتحويل L. reuteri DSM20016 هي توليد ظروف النمو اللاهوائي بعد التحولات المطلية. المستعمرات المكتسبة في الظروف الهوائية هي فقط عرضية جدا وتفشل عموما في النمو عند تلقيحها في مرق MRS. يجب أيضا ممارسة طلاء حجم الاسترداد بالكامل لزيادة احتمالية نمو المستعمرة. حتى مع هاتين الخطوت?.......

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نحن نقدر تقديرا كبيرا المشورة القيمة التي قدمها البروفيسور جي بي فان بيكرين (جامعة ويسكونسن ماديسون) ، الذي قدمت توجيهاته بشأن العمل مع L. reuteri ATCC PTA 6475 أساسا للطرق الموضحة هنا.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb Plus DNA LadderNEBN3200L
1mL Spectrophotometer cuvettesThomas Scientific1145J12
Agarose BioShopAGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)Beckman Allegra N/ANo longer in production
AnaeroGen 2.5 L SachetThermo ScientificOXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation systemVWR58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)FroggaBioTB50-500
DNA gel x6 loading dyeNEBB7024S
Electroporation cuvetteFisherbrandFB101
ErythromycinMillipore SigmaE5389-5G
Gel electroporation bath/dockVWR76314-748
Glycerol BioShopGLY001
Limosilactobacillus reuteriLeibniz Institute DSMZDSM20016Strain designation F275
LysozymeBioShopLYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)FroggaBioLMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)Qiagen27106slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein 
MRS Broth (Dehydrated)Thermo ScientificCM0359B
MutanolysinMillipore SigmaM9901-5KU
NaOH Millipore Sigma1064691000
P100 PipetteEppendorf3123000047
P1000 PipetteEppendorf3123000063
P2.5 PipetteEppendorf3123000012
P20 PipetteEppendorf3123000039
P200 PipetteEppendorf3123000055
PCR tubesFroggaBioSTF-A120S
Personal benchtop microcentrifugeGenlantisE200100
Petri dishesVWR25384-088
PTC-150 Thermal CyclerMJ ResearchN/ANo longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)Addgene27168
SPECTRONIC 200 SpectrophotometerThermo Scientific840-281700
Storage microplateFisher Scientific14-222-225
SucroseBioShopSUC507
TAE Buffer 50xThermo ScientificB49
VortexVWR58816-121No longer in production
VWR 1500E incubatorVWRN/ANo longer in production

References

  1. Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
  2. Zheng, J., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved