Методы подтверждения электропорации и трансформации Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Резюме

Здесь мы представляем протоколы работы с DSM20016 Limosilactobacillus reuteri , подробно описывающие рост, трансформацию плазмиды, ПЦР колоний, измерение флуоресцентного репортерного белка и ограниченную мини-подготовку плазмиды, а также распространенные проблемы и устранение неполадок. Эти протоколы позволяют измерять репортерные белки в DSM20016 или подтверждать с помощью колонии ПЦР, если репортер не участвует.

Аннотация

Lactobacillus были невероятно большим, разнообразным родом бактерий, включающим 261 вид, некоторые из которых были комменсальными штаммами с потенциалом для использования в качестве шасси для синтетических биологических исследований в желудочно-кишечном тракте. Широкая фенотипическая и генотипическая изменчивость, наблюдаемая в пределах рода, привела к недавней реклассификации и введению 23 новых родов.

Из-за широты вариаций в старых родах протоколы, продемонстрированные в одном члене, могут не работать так, как рекламируется с другими членами. Отсутствие централизованной информации о том, как именно манипулировать конкретными штаммами, привело к появлению ряда специальных подходов, часто адаптированных из других семейств бактерий. Это может усложнить ситуацию для исследователей, начинающих работать в этой области, которые могут не знать, какая информация относится или не относится к выбранному ими штамму.

В этой статье мы стремимся централизовать набор протоколов с продемонстрированным успехом, в частности, в обозначении штамма Limosilactobacillus reuteri F275 (другие коллекционные номера: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), а также советы по устранению неполадок и общие проблемы, с которыми можно столкнуться. Эти протоколы должны позволить исследователю, практически не имеющему опыта работы с L. reuteri , DSM20016 трансформировать плазмиду, подтверждать трансформацию и измерять обратную связь системы в считывателе планшетов с помощью репортерного белка.

Введение

Род Lactobacillus исторически классифицировался как грамположительные, палочковидные, неспорообразующие, факультативные анаэробы или микроаэрофилы, которые расщепляют сахара с образованием молочной кислоты¹. Эти свободные критерии привели к тому, что Lactobacillus фенотипически и генотипически является чрезвычайно разнообразным родом. Эта широкая категоризация привела к тому, что род был реклассифицирован, и в 2020 году было введено 23 новых рода².

Старый, более широкий род включал основные комменсальные и пробиотические виды, которые обычно считаются безопасными (GRAS) для п....

протокол

1. Подготовка L. reuteri DSM20016 электрокомпетентных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Это основано на протоколе Berthier et ^al.17 со скоростями центрифугирования, указанными Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. В пробирке центрифуги объемом 50 мл инокулируют L. reuteri из запаса глицерина в 6 мл бульона deMan Rogosa Sharpe (MRS). Аэробная инкубация в течение ночи при 37 ° C в статическом инкубаторе.
2. На следующее утро привите 4 мл ночной культуры в 200 мл бульона MRS (разведение 1:50).
3. Разрешить аэробный рост в статическом инкубаторе с темпе....

Результаты

Эффективность трансформации
L. reuteri не требует dcm-/^{dam-неметилированной} плазмиды, как это наблюдается для других Lactobacillaceae^19,20 (см. рис. 1). Электропорация DSM20016 L. reuteri с 10 мкл плазмидного pTRKH3_mCherry2 размером 8,5 к?.......

Обсуждение

Наиболее важным шагом для трансформации L. reuteri DSM20016 является создание анаэробных условий роста после нанесения покрытий на трансформацию; колонии, полученные в аэробных условиях, встречаются очень редко и, как правило, не растут при инокуляции в бульон MRS. Также следует практикова?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production