Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протоколы работы с DSM20016 Limosilactobacillus reuteri , подробно описывающие рост, трансформацию плазмиды, ПЦР колоний, измерение флуоресцентного репортерного белка и ограниченную мини-подготовку плазмиды, а также распространенные проблемы и устранение неполадок. Эти протоколы позволяют измерять репортерные белки в DSM20016 или подтверждать с помощью колонии ПЦР, если репортер не участвует.

Аннотация

Lactobacillus были невероятно большим, разнообразным родом бактерий, включающим 261 вид, некоторые из которых были комменсальными штаммами с потенциалом для использования в качестве шасси для синтетических биологических исследований в желудочно-кишечном тракте. Широкая фенотипическая и генотипическая изменчивость, наблюдаемая в пределах рода, привела к недавней реклассификации и введению 23 новых родов.

Из-за широты вариаций в старых родах протоколы, продемонстрированные в одном члене, могут не работать так, как рекламируется с другими членами. Отсутствие централизованной информации о том, как именно манипулировать конкретными штаммами, привело к появлению ряда специальных подходов, часто адаптированных из других семейств бактерий. Это может усложнить ситуацию для исследователей, начинающих работать в этой области, которые могут не знать, какая информация относится или не относится к выбранному ими штамму.

В этой статье мы стремимся централизовать набор протоколов с продемонстрированным успехом, в частности, в обозначении штамма Limosilactobacillus reuteri F275 (другие коллекционные номера: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), а также советы по устранению неполадок и общие проблемы, с которыми можно столкнуться. Эти протоколы должны позволить исследователю, практически не имеющему опыта работы с L. reuteri , DSM20016 трансформировать плазмиду, подтверждать трансформацию и измерять обратную связь системы в считывателе планшетов с помощью репортерного белка.

Введение

Род Lactobacillus исторически классифицировался как грамположительные, палочковидные, неспорообразующие, факультативные анаэробы или микроаэрофилы, которые расщепляют сахара с образованием молочной кислоты1. Эти свободные критерии привели к тому, что Lactobacillus фенотипически и генотипически является чрезвычайно разнообразным родом. Эта широкая категоризация привела к тому, что род был реклассифицирован, и в 2020 году было введено 23 новых рода2.

Старый, более широкий род включал основные комменсальные и пробиотические виды, которые обычно считаются безопасными (GRAS) для п....

протокол

1. Подготовка L. reuteri DSM20016 электрокомпетентных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Это основано на протоколе Berthier et al.17 со скоростями центрифугирования, указанными Rattanachaikunsopon et al.18.

  1. В пробирке центрифуги объемом 50 мл инокулируют L. reuteri из запаса глицерина в 6 мл бульона deMan Rogosa Sharpe (MRS). Аэробная инкубация в течение ночи при 37 ° C в статическом инкубаторе.
  2. На следующее утро привите 4 мл ночной культуры в 200 мл бульона MRS (разведение 1:50).
  3. Разрешить аэробный рост в статическом инкубаторе с темпе....

Результаты

Эффективность трансформации
L. reuteri не требует dcm-/dam-неметилированной плазмиды, как это наблюдается для других Lactobacillaceae19,20 (см. рис. 1). Электропорация DSM20016 L. reuteri с 10 мкл плазмидного pTRKH3_mCherry2 размером 8,5 к?.......

Обсуждение

Наиболее важным шагом для трансформации L. reuteri DSM20016 является создание анаэробных условий роста после нанесения покрытий на трансформацию; колонии, полученные в аэробных условиях, встречаются очень редко и, как правило, не растут при инокуляции в бульон MRS. Также следует практикова?.......

Раскрытие информации

Конфликта интересов не существует.

Благодарности

Мы высоко ценим ценные советы, предоставленные профессором Й.. ван Пейкереном (Университет Висконсин-Мэдисон), чье руководство по работе с L. reuteri ATCC PTA 6475 послужило основой для описанных здесь методов.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb Plus DNA LadderNEBN3200L
1mL Spectrophotometer cuvettesThomas Scientific1145J12
Agarose BioShopAGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)Beckman Allegra N/ANo longer in production
AnaeroGen 2.5 L SachetThermo ScientificOXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation systemVWR58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)FroggaBioTB50-500
DNA gel x6 loading dyeNEBB7024S
Electroporation cuvetteFisherbrandFB101
ErythromycinMillipore SigmaE5389-5G
Gel electroporation bath/dockVWR76314-748
Glycerol BioShopGLY001
Limosilactobacillus reuteriLeibniz Institute DSMZDSM20016Strain designation F275
LysozymeBioShopLYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)FroggaBioLMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)Qiagen27106slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein 
MRS Broth (Dehydrated)Thermo ScientificCM0359B
MutanolysinMillipore SigmaM9901-5KU
NaOH Millipore Sigma1064691000
P100 PipetteEppendorf3123000047
P1000 PipetteEppendorf3123000063
P2.5 PipetteEppendorf3123000012
P20 PipetteEppendorf3123000039
P200 PipetteEppendorf3123000055
PCR tubesFroggaBioSTF-A120S
Personal benchtop microcentrifugeGenlantisE200100
Petri dishesVWR25384-088
PTC-150 Thermal CyclerMJ ResearchN/ANo longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)Addgene27168
SPECTRONIC 200 SpectrophotometerThermo Scientific840-281700
Storage microplateFisher Scientific14-222-225
SucroseBioShopSUC507
TAE Buffer 50xThermo ScientificB49
VortexVWR58816-121No longer in production
VWR 1500E incubatorVWRN/ANo longer in production

Ссылки

  1. Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
  2. Zheng, J., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены