罗伊氏乳酸杆菌电穿孔和转化确认的方法DSM20016

摘要

在这里，我们提出了使用 罗伊氏利莫西乳杆菌 DSM20016的方案，详细介绍了生长、质粒转化、集落PCR、荧光报告蛋白测量和有限的质粒迷你制备，以及常见问题和故障排除。这些方案允许测量DSM20016中的报告蛋白，或者在没有报告基因的情况下 通过 集落PCR进行确认。

摘要

乳酸杆菌 是一个令人难以置信的大，多样化的细菌属，包括261种，其中几种是共生菌株，有可能用作胃肠道内合成生物学努力的底盘。在该属内观察到的广泛表型和基因型变异导致最近的重新分类和23个新属的引入。

由于旧属内变异的广度，在一个成员中展示的协议可能无法像其他成员所宣传的那样有效。缺乏关于如何精确操纵特定菌株的集中信息导致了一系列 临时 方法，通常改编自其他细菌家族。对于从该领域开始的研究人员来说，这可能会使事情复杂化，他们可能不知道哪些信息适用于或不适用于他们选择的菌株。

在本文中，我们的目标是集中一组已证明成功的协议，特别是在 罗伊氏利莫西乳杆菌 菌株名称F275（其他收集编号:DSM20016，ATCC23272，CIP109823）中，以及故障排除建议和可能遇到的常见问题。这些方案应使几乎没有罗 伊氏乳杆菌 DSM20016经验的研究人员能够通过报告蛋白 转化 质粒，确认转化并测量酶标仪中的系统反馈。

引言

乳酸杆菌属在历史上被归类为革兰氏阳性、杆状、非孢子形成、兼性厌氧菌或微需氧菌，其分解糖主要产生乳酸¹。这些松散的标准导致乳酸杆菌在表型和基因型上是一个极其多样化的属。这种广泛的分类导致该属被重新分类，在 2020 年引入了 23 个新属².

较老的、更广泛的属包括通常被认为可以安全食用的主要共生菌和益生菌物种 （GRAS）³。乳酸杆菌科保持着公众对"好细菌"的看法，因为许多报道通过食用^各种菌株4,5,6,7赋予健康益处。它们在胃肠道中导航的便利性⁸ 和公众的接受度相结合，使乳酸杆菌科菌株成为可摄入药用、治疗或诊断应用的底盘生物的有力候选者。

乳酸杆菌科内存在广泛的特征，导致没有事实上的模式生物菌株的情况;研究小组倾向于选择与其特定目标最相关的物种。（例如，乳品发酵实验室可以选择乳乳杆菌;蔬菜发酵研究可能会选择植物乳杆菌;益生菌研究可能集中在嗜酸乳杆菌上;等等。

跨物种的这种广泛特征导致了协议和程序的积累，这些协议和程序可能对 乳酸杆菌科 的一个子集有效，但需要优化才能在其他亚群中有效工作（或者可能根本起作用）⁹。这种在家族成员之间甚至同一物种的成员内部进行优化的需求可能会挫败不熟悉的研究人员的努力。发表在论文方法部分的协议也可以包括自己的修改¹⁰，导致碎片化，分散的协议集合。

罗伊氏乳杆菌被认为是一种广泛的脊椎动物共生动物，在哺乳动物、鸟类¹¹ 和鱼类¹² 胃肠道 （GI） 中始终存在。罗伊氏乳杆菌亚菌株通常在遗传上特化，通过粘液粘附蛋白适应，更永久地定植特定的天然宿主8,11,13。胃肠道 Limosilactobacillus属可以在其原生宿主以外的宿主中分离出来，但更倾向于短暂性⁸。

由于人类宿主的专业化， 罗伊氏乳杆菌 DSM20016很好地定位为人类胃肠道任何点的诊断或治疗应用的底盘，与更短暂的菌株相比，菌株DSM20016可以为干预提供更持久的效果窗口。

在本文中，我们概述了一系列在 罗伊氏利莫西乳杆菌 （菌株名称:F275;其他收集编号:DSM20016，ATCC23272，CIP109823）中证明有效的协议，以及来自其他来源的菌株的集中信息，以帮助分子和系统生物学应用。本文列出的程序应使没有先前经验的研究人员能够培养 罗伊氏乳杆菌，创建电感受态储液，选择转化的菌落，通过菌落聚合酶链反应（PCR） 确认 转化，并通过荧光报告蛋白 测量 设计的系统反应。

我们注意到相关协议已经涵盖了罗伊氏乳杆菌（菌株:ATCC-PTA-6475）¹⁴中的CRISPR-Cas9辅助ssDNA基因组重组，以及多个非罗伊氏乳杆菌，乳杆菌科染色剂^15,16的CRSIPR-Cas9切口酶辅助基因组编辑;然而，这些并没有解决罗伊氏乳杆菌DSM20016菌株，这是我们在这里的重点。

研究方案

1. 制备 罗伊氏乳杆菌 DSM20016电感受态细胞

注意:这是基于Berthier等人¹⁷的协议，离心速度由Rattanachaikunsopon等人告知。¹⁸.

1. 在 50 mL 离心管中，将来自甘油原液的 罗伊氏乳杆菌 接种到 6 mL 的 deMan Rogosa Sharpe （MRS） 肉汤中。在静态培养箱中于37°C有氧孵育过夜。
2. 第二天早上，将 4 mL 过夜培养物接种到 200 mL MRS 肉汤中（1:50 稀释）。
3. 允许在静态37°C培养箱中有氧生长，直到600nm光密度值（OD 600）达到0.5-0.85;这大约需要2-3小时。
4. 一旦达到足够的OD 600值，将培养基倒入50 mL离心管中，并放在冰上，同时平衡管。
5. 在预冷的4°C离心机中以5,000× g 离心5分钟。
6. 弃去上清液，将每个沉淀重悬于50mL预冷（0°C至4°C）ddH₂O中，并以与上一步相同的设置再次离心。尽可能将细胞保持在冰上。
7. 重复步骤 1.6。
8. 将每个沉淀重悬于25mL ddH₂O:0.5 M蔗糖，10%甘油中。在4°C下以5,000× g 离心10分钟。弃去上清液并将细胞放回冰上。
9. 将所有沉淀重悬于相同的 2 mL ddH₂O 中:0.5 M 蔗糖，10% 甘油。
10. 在预冷的微量离心管中等分到 50 μL 至 100 μL 份中;储存在-80°C以备后用。

2. 罗伊氏乳杆菌的电穿孔

注意:在以下步骤中尽可能避免移液。建议加入不添加质粒的对照电穿孔，以确保抗生素选择充分。

1. 取整个电能力 罗伊氏乳杆菌 等分试样，在冰上解冻。
2. 将 5 μL 至 10 μL 质粒（最终质粒浓度 >6 nM）轻轻混合到解冻的等分试样中，尽可能避免移液。
3. 转移到冰冷的1毫米间隙电穿孔比色皿中。
4. 在 1.25 kV、400 Ω 和 25 μF 下电穿孔。
5. 加入 1 mL 室温 （RT） MRS 肉汤，将比色皿倒置一次或两次混合。
6. 将比色皿放入37°C的静态培养箱中2.5-3小时以允许恢复。
7. 将全部量接种到多个MRS琼脂平板上，并进行适当的选择。
8. 将盘子放在一个完全密封的容器中，用一根点燃的小蜡烛（"茶灯"）和一个产生厌氧气氛的小袋。
9. 在37°C下生长2-3天或直到存在可见菌落。

3. 耐酸荧光报告蛋白mCherry2的测量

1. 选择测量所需的任何菌落，并接种到96孔储存微孔板中，每孔含有1.5 mL过滤灭菌（非高压灭菌）MRS肉汤和适当选择的抗生素。
2. 在37°C下有氧孵育24小时过夜，不摇动。
   注意:该储存微孔板应保留用于第4节（菌落PCR）。
3. 罗伊氏乳杆菌 在固定相时会从培养基中沉淀出来;通过移液 重 悬过夜培养物。
4. 将 200 μL 转移到平坦、透明底部的 96 孔板中，将板转移到读板器中，并测量 mCherry2（激发 [Ex]:589 nm;发射 [Em]:610 nm）或其他相关报告基因的 OD 和荧光。

4. 通过菌落PCR 确认 质粒摄取

1. 从第 3 节的 96 孔储存微孔板中，将 5 μL 转移到 PCR 管中。
   注意:如果经过>5分钟，可能需要再次重悬罗 伊氏乳杆菌 。
2. 在便携式台式微量离心机中，向下旋转直至可以看到沉淀（在2,000 x g 下约2分钟），弃去上清液，并将沉淀重悬于20μL 20mM NaOH中。
3. 在95°C下煮沸5分钟，涡旋，然后再次重复煮沸。
4. 立即冷却样品;在以下步骤中，尽量将样品保持在冰上，以降低模板降解和PCR抑制的可能性。
5. 在便携式台式微量离心机中以 2,000 x g 离心 2 分钟，直到细胞碎片沉淀，然后取 1 μL 上清液并稀释到 99 μL 冰冷的 DNase 和 RNase 不含 ddH₂O （100 倍稀释）。
6. 使用质粒特异性引物在标准PCR反应中使用100倍稀释液作为模板DNA。包括一个阳性对照，其中包含源自 大肠杆菌 迷你制备的质粒。
7. 将样品放在冰上，并以1x浓度添加适当的上样染料。
8. 在TAE缓冲液（三乙酸酯-乙二胺四乙酸[EDTA]）中的1%琼脂糖凝胶中以110V运行30分钟。如有必要，图像。

5. 罗伊氏乳杆菌 的小型制备方案，然后进行PCR以确认质粒的存在

注意:用于 材料表中列出的小型制备试剂盒的协议。

1. 将 罗伊氏乳杆菌 接种到含有适当抗生素的10mLMRS肉汤中，并在静态培养箱中于37°C有氧孵育过夜。
2. 在预冷的4°C离心机中以5,000× g 离心10分钟。
3. 在 2 mL 标准 P1 缓冲液（包含在试剂盒中）中洗涤沉淀以消除可能干扰后续步骤的酸度，以与前面描述的相同设置离心，并弃去上清液。
4. 将沉淀重悬于含有 10 mg/mL 溶菌酶和 100 U/mL 变溶素的 250 μL 改良 P1 缓冲液中，以裂解细菌细胞。在37°C孵育1-2小时。
5. 加入 250 μL 缓冲液 P2，倒置混合 4-6 次，并在室温下孵育不超过 5 分钟。
6. 加入 350 μL 缓冲液 N3（包含在试剂盒中），并立即轻轻倒置 4 至 6 次以混合。
7. 以10,000 x g 离心10分钟。
8. 将尽可能多的上清液转移到离心柱中，并以10,000 x g 离心60秒。丢弃流过。
9. 用 500 μL 缓冲液 PB（包含在试剂盒中）洗涤离心柱，并以 10,000 x g 离心 60 秒。丢弃流过。
10. 用 750 μL 缓冲液 PE（包含在试剂盒中）洗涤离心柱，并以 10,000 x g 离心 60 秒。丢弃流过并离心60秒以除去任何残留的缓冲液。
11. 将离心柱放入 1.5 mL 微量离心管中。将 20-30 μL 不含 DNA 酶和 RNA 酶的 ddH 2 O 施加到离心柱的过滤器中并放置_1-2分钟，然后以 10,000 x g 离心 60 秒。
12. 使用质粒特异性引物（pTRKH3_pTUSeq_F:CACCCGTTCGGAGCA，pTRKH3_pTUSeq_R:CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA）进行标准PCR反应，洗脱液提供模板DNA。包括一个阳性对照，其中包含源自 大肠杆菌 迷你制备的质粒。
    注意:本研究中使用的PCR设置为:98°C5分钟，（98°C30秒，55°C30秒，72°C45秒）30个循环，72°C2分钟，4°C保持。参数高度依赖于所使用的聚合酶、片段长度以及使用该协议的任何人使用的确切引物。

结果

转型效率
罗伊氏乳杆菌不需要dcm^-/dam^-非甲基化质粒，如其他乳酸杆菌科^19,20所观察到的那样（见图1）。无论质粒甲基化条件如何，用 10 μL 8.5 kb 质粒pTRKH3_mCherry2（pAMβ1 theta 复制起源）电穿罗伊氏乳杆菌DSM20016应具有大约 80 个菌落形成单位 （CFU）/μg（每 200 μL 镀板 5 至 8 个菌落?...

讨论

罗伊氏乳杆菌DSM20016转化的最关键步骤是转化后产生厌氧生长条件;在有氧条件下获得的菌落只是非常偶然的，并且在接种MRS肉汤中时通常无法生长。还应练习对整个回收体积进行铺板，以最大限度地提高菌落生长的可能性。即使有这两个关键步骤，转化效率仍然是实验的限制，因为在转化过程中，预期的菌落数量可能低至每个板一个或两个（见图1）。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production