罗伊氏乳酸杆菌电穿孔和转化确认的方法DSM20016

摘要

在这里，我们提出了使用 罗伊氏利莫西乳杆菌 DSM20016的方案，详细介绍了生长、质粒转化、集落PCR、荧光报告蛋白测量和有限的质粒迷你制备，以及常见问题和故障排除。这些方案允许测量DSM20016中的报告蛋白，或者在没有报告基因的情况下 通过 集落PCR进行确认。

摘要

乳酸杆菌 是一个令人难以置信的大，多样化的细菌属，包括261种，其中几种是共生菌株，有可能用作胃肠道内合成生物学努力的底盘。在该属内观察到的广泛表型和基因型变异导致最近的重新分类和23个新属的引入。

由于旧属内变异的广度，在一个成员中展示的协议可能无法像其他成员所宣传的那样有效。缺乏关于如何精确操纵特定菌株的集中信息导致了一系列 临时 方法，通常改编自其他细菌家族。对于从该领域开始的研究人员来说，这可能会使事情复杂化，他们可能不知道哪些信息适用于或不适用于他们选择的菌株。

在本文中，我们的目标是集中一组已证明成功的协议，特别是在 罗伊氏利莫西乳杆菌 菌株名称F275（其他收集编号：DSM20016，ATCC23272，CIP109823）中，以及故障排除建议和可能遇到的常见问题。这些方案应使几乎没有罗 伊氏乳杆菌 DSM20016经验的研究人员能够通过报告蛋白 转化 质粒，确认转化并测量酶标仪中的系统反馈。

引言

乳酸杆菌属在历史上被归类为革兰氏阳性、杆状、非孢子形成、兼性厌氧菌或微需氧菌，其分解糖主要产生乳酸¹。这些松散的标准导致乳酸杆菌在表型和基因型上是一个极其多样化的属。这种广泛的分类导致该属被重新分类，在 2020 年引入了 23 个新属².

较老的、更广泛的属包括通常被认为可以安全食用的主要共生菌和益生菌物种 （GRAS）³。乳酸杆菌科保持着公众对“好细菌”的看法，因为许多报道通过食用^各种菌株4,5,6,7赋予健康益处。它们在胃肠道中导航的便利性⁸ 和公众的接受度相结合，使乳酸杆菌科菌株成为可摄入药用、治疗或诊断应用的底盘生物的有力候选者。

乳酸杆菌科内存在广泛的特征，导致没有事实上的模式生物菌株的情况;研究小组倾向于选择与其特定目标最相关的物种。（例如，....

研究方案

1. 制备 罗伊氏乳杆菌 DSM20016电感受态细胞

注意：这是基于Berthier等人¹⁷的协议，离心速度由Rattanachaikunsopon等人告知。¹⁸.

1. 在 50 mL 离心管中，将来自甘油原液的 罗伊氏乳杆菌 接种到 6 mL 的 deMan Rogosa Sharpe （MRS） 肉汤中。在静态培养箱中于37°C有氧孵育过夜。
2. 第二天早上，将 4 mL 过夜培养物接种到 200 mL MRS 肉汤中（1：50 稀释）。
3. 允许在静态37°C培养箱中有氧生长，直到600nm光密度值（OD 600）达到0.5-0.85;这大约需要2-3小时。
4. 一旦达到足够的OD 600值，将培养基倒入50 mL离心管中，并放在冰上，同时平衡管。
5. 在预冷的4°C离心机中以5,000× g 离心5分钟。
6. 弃去上清液，将每个沉淀重悬于50mL预冷（0°C至4°C）ddH₂O中，并以与上一步相同的设置再次离心。尽可能将细胞保持在冰上。
7. 重复步骤 1.6。
8. 将每个沉淀重悬于25mL ddH₂....

讨论

罗伊氏乳杆菌DSM20016转化的最关键步骤是转化后产生厌氧生长条件;在有氧条件下获得的菌落只是非常偶然的，并且在接种MRS肉汤中时通常无法生长。还应练习对整个回收体积进行铺板，以最大限度地提高菌落生长的可能性。即使有这两个关键步骤，转化效率仍然是实验的限制，因为在转化过程中，预期的菌落数量可能低至每个板一个或两个（见图1）。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production