Limosilactobacillus reuteri DSM20016의 전기천공 및 변형 확인 방법

요약

여기에서는 리 모실락토바실러스 루테리 DSM20016 작업을 위한 프로토콜, 성장, 플라스미드 형질전환, 콜로니 PCR, 형광 리포터 단백질 측정, 제한된 플라스미드 미니 프렙, 일반적인 문제 및 문제 해결을 자세히 설명합니다. 이러한 프로토콜을 통해 DSM20016에서 리포터 단백질을 측정하거나 리포터가 관여하지 않는 경우 콜로니 PCR을 통해 확인할 수 있습니다.

초록

락토바실러스 는 261종으로 구성된 믿을 수 없을 정도로 크고 다양한 박테리아 속으로, 그 중 일부는 위장관 내에서 합성 생물학적 노력을 위한 섀시로 사용할 수 있는 공생 균주였습니다. 속 내에서 관찰된 광범위한 표현형 및 유전형 변이로 인해 최근 재분류와 23개의 새로운 속이 도입되었습니다.

이전 속의 다양한 변형으로 인해 한 구성원에서 입증된 프로토콜이 다른 구성원과 함께 광고된 대로 작동하지 않을 수 있습니다. 특정 균주를 정확히 조작하는 방법에 대한 중앙 집중식 정보가 부족하여 종종 다른 박테리아 계열에서 채택된 다양한 임시 접근 방식이 도입되었습니다. 이것은 현장에서 시작하는 연구자들에게 문제를 복잡하게 만들 수 있으며, 어떤 정보가 자신이 선택한 균주에 적용되는지 또는 적용되지 않는지 모를 수 있습니다.

이 백서에서는 특히 리모실락토바실러스 루테리 균주 명칭 F275(기타 수집 번호: DSM20016, ATCC23272, CIP109823)에서 입증된 성공 프로토콜 세트와 함께 문제 해결 조언 및 발생할 수 있는 일반적인 문제를 중앙 집중화하는 것을 목표로 합니다. 이러한 프로토콜은 L. 루테리 DSM20016 사용한 경험이 거의 또는 전혀 없는 연구자가 플라스미드를 형질전환하고, 형질전환을 확인하고, 리포터 단백질을 통해 플레이트 판독기에서 시스템 피드백을 측정할 수 있도록 해야 합니다.

서문

락토바실러스(Lactobacillus) 속은 역사적으로 그람 양성, 막대 모양, 포자 형성이 없는 통성 혐기성 세균 또는 주로 젖산¹을 생성하기 위해 당을 분해하는 미세호기성 미생물로 분류되었습니다. 이러한 느슨한 기준으로 인해 락토바실러스는 표현형적으로나 유전형적으로 매우 다양한 속이 되었습니다. 이러한 광범위한 분류로 인해 속이 재분류되어 2020년에 23개의 새로운 속이 도입되었습니다².

오래되고 더 넓은 속(genus)에는 일반적으로 섭취하기에 안전한 것으로 간주되는(GRAS) 주요 공생 및 프로바이오틱 종(probiotic species)이 포함되었다³. 락토바실라과(Lactobacillaceae)는 다양한 균주 ^4,5,6,7의 섭취를 통해 제공되는 많은 보고된 건강상의 이점으로 인해 '좋은 박테리아'라는 대중의 인식....

프로토콜

1. L. 루테리 DSM20016 전기적격 전지 준비

참고: 이것은 Berthier et ^al.17의 프로토콜을 기반으로 하며 원심분리 속도는 Rattanachaikunsopon et al.에서 알려줍니다.¹⁸.

1. 50mL 원심분리기 튜브에서 글리세롤 스톡의 L. 루테리 를 6mL의 deMan Rogosa Sharpe(MRS) 브로스에 접종합니다. 정적 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 호기적으로 배양합니다.
2. 다음날 아침, 하룻밤 배양액 4mL를 MRS 브로스 200mL에 접종합니다(1:50 희석).
3. 600nm 광학 밀도 값(OD600)이 0.5-0.85에 도달할 때까지 정적 37°C 인큐베이터에서 호기성으로 성장하도록 합니다. 대략 2-3시간이 소요됩니다.
4. 적절한 OD600 값에 도달하면 매체를 50mL 원심분리기 튜브에 디캔팅하고 튜브의 균형을 맞추면서 얼음 위에 놓습니다.
5. 미리 냉각된 4°C 원심분리기에서 5,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
<....

토론

L. 루테리 DSM20016의 형질전환을 위한 가장 중요한 단계는 형질전환이 도금된 후 혐기성 성장 조건의 생성입니다. 호기성 조건에서 얻은 콜로니는 매우 가끔씩만 발생하며 일반적으로 MRS 국물에 접종하면 성장하지 않습니다. 콜로니 성장 가능성을 최대화하기 위해 전체 회수량을 도금하는 것도 연습해야 합니다. 이 두 가지 중요한 단계에도 불구하고, 형질전환 효율은 여전히 실험의 한계이?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production