Limosilactobacillus reuteri DSM20016의 전기천공 및 변형 확인 방법

요약

여기에서는 리 모실락토바실러스 루테리 DSM20016 작업을 위한 프로토콜, 성장, 플라스미드 형질전환, 콜로니 PCR, 형광 리포터 단백질 측정, 제한된 플라스미드 미니 프렙, 일반적인 문제 및 문제 해결을 자세히 설명합니다. 이러한 프로토콜을 통해 DSM20016에서 리포터 단백질을 측정하거나 리포터가 관여하지 않는 경우 콜로니 PCR을 통해 확인할 수 있습니다.

초록

락토바실러스 는 261종으로 구성된 믿을 수 없을 정도로 크고 다양한 박테리아 속으로, 그 중 일부는 위장관 내에서 합성 생물학적 노력을 위한 섀시로 사용할 수 있는 공생 균주였습니다. 속 내에서 관찰된 광범위한 표현형 및 유전형 변이로 인해 최근 재분류와 23개의 새로운 속이 도입되었습니다.

이전 속의 다양한 변형으로 인해 한 구성원에서 입증된 프로토콜이 다른 구성원과 함께 광고된 대로 작동하지 않을 수 있습니다. 특정 균주를 정확히 조작하는 방법에 대한 중앙 집중식 정보가 부족하여 종종 다른 박테리아 계열에서 채택된 다양한 임시 접근 방식이 도입되었습니다. 이것은 현장에서 시작하는 연구자들에게 문제를 복잡하게 만들 수 있으며, 어떤 정보가 자신이 선택한 균주에 적용되는지 또는 적용되지 않는지 모를 수 있습니다.

이 백서에서는 특히 리모실락토바실러스 루테리 균주 명칭 F275(기타 수집 번호: DSM20016, ATCC23272, CIP109823)에서 입증된 성공 프로토콜 세트와 함께 문제 해결 조언 및 발생할 수 있는 일반적인 문제를 중앙 집중화하는 것을 목표로 합니다. 이러한 프로토콜은 L. 루테리 DSM20016 사용한 경험이 거의 또는 전혀 없는 연구자가 플라스미드를 형질전환하고, 형질전환을 확인하고, 리포터 단백질을 통해 플레이트 판독기에서 시스템 피드백을 측정할 수 있도록 해야 합니다.

서문

락토바실러스(Lactobacillus) 속은 역사적으로 그람 양성, 막대 모양, 포자 형성이 없는 통성 혐기성 세균 또는 주로 젖산¹을 생성하기 위해 당을 분해하는 미세호기성 미생물로 분류되었습니다. 이러한 느슨한 기준으로 인해 락토바실러스는 표현형적으로나 유전형적으로 매우 다양한 속이 되었습니다. 이러한 광범위한 분류로 인해 속이 재분류되어 2020년에 23개의 새로운 속이 도입되었습니다².

오래되고 더 넓은 속(genus)에는 일반적으로 섭취하기에 안전한 것으로 간주되는(GRAS) 주요 공생 및 프로바이오틱 종(probiotic species)이 포함되었다³. 락토바실라과(Lactobacillaceae)는 다양한 균주 ^4,5,6,7의 섭취를 통해 제공되는 많은 보고된 건강상의 이점으로 인해 '좋은 박테리아'라는 대중의 인식을 유지하고 있습니다. 위장관을 쉽게 탐색할 수 있는 방법⁸과 대중의 인정은 락토바실라과(Lactobacillaceae) 균주를 섭취 가능한 의약, 치료 또는 진단 응용 분야를 위한 섀시 유기체와 같은 강력한 후보로 포지셔닝합니다.

Lactobacillaceae 계통에 존재하는 광범위한 특성으로 인해 사실상의 모델-유기체 균주가 없는 상황이 발생했습니다. 연구 그룹은 특정 목표와 가장 관련이있는 특성을 가진 종을 선택하는 경향이 있습니다. (예를 들어, 유제품 발효 실험실은 L. lactis를 선택할 수 있고, 식물성 발효 연구는 L. plantarum을 선택할 수 있으며, 프로바이오틱스에 대한 연구는 L. acidophilus에 초점을 맞출 수 있습니다.)

종에 걸친 이와 같은 광범위한 특성으로 인해 락토바실라과(Lactobacillaceae ) 계열의 한 하위 집합에서는 잘 작동할 수 있지만 다른 부분집합에서는 효율적으로 작동하기 위해(또는 전혀 기능하지 않는) 최적화가 필요한 프로토콜과 절차가 축적되었습니다⁹. 가족 구성원 간, 심지어 같은 종의 구성원 내에서도 최적화에 대한 이러한 필요성은 익숙하지 않은 연구자의 노력을 좌절시킬 수 있습니다. 논문의 방법 섹션에 발표된 프로토콜은 또한 그들 자신의 수정(¹⁰)을 포함할 수 있으며, 이는 단편화되고 분산된 프로토콜 모음으로 이어진다.

L. 루테리(L. reuteri)는 포유류, 조류¹¹ 및 어류¹² 위장관(GI)에서 일관되게 발견되는 널리 척추동물 공생동물로 여겨진다. L. 루테리 하위 균주는 종종 점액 접착 단백질 적응을 통해 유전적으로 특수화되어 특정 토착 숙주를 보다 영구적으로 식민지화합니다 8,11,13. 위장관 리모실락토바실러스(Limosilactobacillus) 종은 본래 숙주 외부의 숙주에서 분리될 수 있지만, 일시적인 성질을 띠는 경향이 있다⁸.

인간-숙주 전문화로 인해 L. 루테리 DSM20016는 인간 위장관의 어느 지점에서든 진단 또는 치료 적용을 위한 섀시로 매우 잘 자리 잡았으며, 균주 DSM20016은 더 일시적인 균주와 비교할 때 중재에 더 오래 지속되는 효과 창을 제공할 수 있습니다.

이 논문에서는 분자 및 시스템 생물학 응용 분야에 도움이 되는 다른 출처의 균주에 대한 중앙 집중식 정보와 함께 Limosilactobacillus reuteri( 균주 명칭: F275, 기타 수집 번호: DSM20016, ATCC23272, CIP109823)에서 효과가 입증된 일련의 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 여기에 제시된 절차는 L. reuteri를 배양하고, 전기적격 스톡을 생성하고, 형질전환된 콜로니를 선택하고, 콜로니 중합효소 연쇄 반응(PCR) 을 통해 형질을 확인하고, 형광 리포터 단백질을 통해 설계된 시스템 반응을 측정할 수 있도록 해야 합니다.

관련 프로토콜은 L. 루테리(L. reuteri, 균주: ATCC-PTA-6475)14에서 CRISPR-Cas9 보조 ssDNA 게놈 재조합 및 여러 non-L에서 CRSIPR-Cas9 nickase-assisted genome editing을 다루었습니다. 루테리, 락토바실라과(Lactobacillaceae) 계열 염색^15,16; 그러나 이것들은 여기서 우리가 초점을 맞추는 L. reuteri DSM20016 균주를 다루지 않습니다.

프로토콜

1. L. 루테리 DSM20016 전기적격 전지 준비

참고: 이것은 Berthier et ^al.17의 프로토콜을 기반으로 하며 원심분리 속도는 Rattanachaikunsopon et al.에서 알려줍니다.¹⁸.

1. 50mL 원심분리기 튜브에서 글리세롤 스톡의 L. 루테리 를 6mL의 deMan Rogosa Sharpe(MRS) 브로스에 접종합니다. 정적 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 호기적으로 배양합니다.
2. 다음날 아침, 하룻밤 배양액 4mL를 MRS 브로스 200mL에 접종합니다(1:50 희석).
3. 600nm 광학 밀도 값(OD600)이 0.5-0.85에 도달할 때까지 정적 37°C 인큐베이터에서 호기성으로 성장하도록 합니다. 대략 2-3시간이 소요됩니다.
4. 적절한 OD600 값에 도달하면 매체를 50mL 원심분리기 튜브에 디캔팅하고 튜브의 균형을 맞추면서 얼음 위에 놓습니다.
5. 미리 냉각된 4°C 원심분리기에서 5,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
6. 상청액을 버리고, 각각의 펠릿을 50 mL의 예비냉각된(0°C 내지 4°C)_ddH2O에 재현탁하고, 이전 단계와 동일한 설정으로 다시 원심분리한다. 세포를 가능한 한 얼음 위에 보관하십시오.
7. 1.6단계를 반복합니다.
8. 각각의 펠릿을 25 mL의_ddH2O:0.5 M 수크로오스, 10% 글리세롤에 재현탁시킨다. 4°C에서 5,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포를 다시 얼음 위에 놓습니다.
9. 모든 펠릿을 동일한 2 mL의_ddH2O:0.5 M 수크로오스, 10% 글리세롤로 재현탁시킨다.
10. 50 μL 내지 100 μL 분취액을 미리 냉각된 미세원심분리 튜브에 넣는 단계; 나중에 사용할 수 있도록 -80 °C에서 보관하십시오.

2. L. 루테리 의 전기천공법

참고: 다음 단계에서 가능한 한 피펫팅을 피하십시오. 플라스미드가 추가되지 않은 대조군 전기천공을 포함하는 것은 항생제 선택이 적절한지 확인하는 것이 좋습니다.

1. 전기 능력이 있는 L. 루테리 분취량을 통째로 취하여 얼음 위에서 해동합니다.
2. 5 μL에서 10 μL의 플라스미드(최종 플라스미드 농도 >6 nM)를 해동된 분취량에 부드럽게 혼합하여 피펫팅을 최대한 피합니다.
3. 얼음으로 식힌 1mm 간격의 전기천공 큐벳으로 옮깁니다.
4. 1.25kV, 400 Ω 및 25μF에서 전기증착.
5. 실온(RT) MRS 육수 1mL를 넣고 큐벳을 한두 번 뒤집어 섞습니다.
6. 큐벳을 37°C의 정적 인큐베이터에 2.5-3시간 동안 넣어 회복을 허용합니다.
7. 적절한 선택으로 전체 양을 여러 MRS 한천 플레이트에 플레이트합니다.
8. 작은 불이 켜진 양초("티라이트")와 혐기성 대기 생성 향 주머니가 있는 완전히 밀폐된 용기 안에 접시를 넣습니다.
9. 37 °C에서 2-3일 동안 또는 눈에 보이는 집락이 나타날 때까지 성장시킵니다.

3. 내산성 형광 리포터 단백질 mCherry2의 측정

1. 측정에 필요한 콜로니를 선택하고 웰당 1.5mL의 필터 멸균(비오토클레이브) MRS 브로스와 적절한 선택 항생제가 포함된 96웰 보관 마이크로플레이트에 접종합니다.
2. 흔들리지 않고 37°C에서 하룻밤 동안 24시간 동안 호기적으로 배양합니다.
   참고: 이 보관 마이크로플레이트는 섹션 4(콜로니 PCR)에서 사용하기 위해 보관해야 합니다.
3. L. reuteri 는 정지 단계에 있을 때 배지 밖으로 침전됩니다. 피펫팅을 통해 하룻밤 배양을 다시 중단합니다.
4. 200 μL를 평평하고 깨끗한 바닥의 96 웰 플레이트에 옮기고, 플레이트를 플레이트 리더로 옮기고, mCherry2 (여기 [Ex] : 589 nm; 방출 [Em] : 610 nm) 또는 기타 관련 리포터의 OD 및 형광을 측정합니다.

4. 콜로니 PCR을 통한 플라스미드 흡수 확인

1. 섹션 3의 96웰 보관 마이크로플레이트에서 5μL를 PCR 튜브로 옮깁니다.
   알림: >5분이 경과하면 L. 루테리 를 두 번째로 다시 중단해야 할 수도 있습니다.
2. 휴대용 탁상용 미세 원심분리기에서 펠릿이 보일 때까지 회전하고(2,000 x g에서 약 2분), 상층액을 버리고, 펠릿을 20mM NaOH 20μL에 재현탁합니다.
3. 95°C에서 5분간 끓이다가 소용돌이치고 두 번 끓인다.
4. 즉시 샘플을 식히십시오. 주형 분해 및 PCR 억제 가능성을 낮추기 위해 다음 단계에서 샘플을 가능한 한 얼음에 보관하십시오.
5. 세포 파편이 펠릿화될 때까지 2,000 x g 의 휴대용 벤치탑 미세 원심분리기에서 2분 동안 스핀다운한 다음 상층액 1μL를 취하여 얼음처럼 차가운 DNase 및 RNase가 없는 ddH_2O99μL로 희석합니다(100x 희석).
6. 플라스미드 특이적 프라이머를 사용하는 표준 PCR 반응에서 100x 희석액을 주형 DNA로 사용합니다. 양성 대조군을 E. coli mini-prep 유래의 플라스미드로 포함시킨다.
7. 샘플을 얼음 위에 놓고 1x 농도로 적절한 로딩 염료를 추가합니다.
8. TAE 완충액(트리스-아세테이트-에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA])의 1% 아가로스 겔에서 110V에서 30분 동안 실행합니다. 필요한 경우 이미지.

5. L. 루테리 에 대한 미니 프렙 프로토콜, 플라스미드 존재를 확인하기 위한 PCR이 뒤따랐습니다.

알림: 재료 표에 나열된 미니 준비 키트와 함께 사용하기 위한 프로토콜입니다.

1. 적절한 항생제가 들어 있는 MRS 브로스 10mL에 L. 루테리 를 접종하고 정적 배양기에서 37°C에서 하룻밤 동안 호기적으로 배양합니다.
2. 미리 냉각된 4°C 원심분리기에서 10분 동안 5,000 x g 로 원심분리합니다.
3. 이후 단계를 방해할 수 있는 산도를 무효화하기 위해 표준 P1 완충액 2mL(키트에 포함)로 펠릿을 세척하고, 이전에 설명한 것과 동일한 설정으로 원심분리하고, 상층액을 버립니다.
4. 박테리아 세포를 용해하기 위해 10mg/mL 리소자임과 100U/mL 뮤타놀리신을 포함하는 변형된 P250 완충액 250μL에 펠릿을 재현탁합니다. 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.
5. 250 μL의 완충액 P2를 첨가하고, 4-6회 반전하여 혼합하고, 5분 이상 RT에서 배양한다.
6. 350 μL의 완충액 N3(키트에 포함)를 넣고 즉시 4-6회 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
7. 10,000 x g 에서 10분 동안 원심분리기.
8. 가능한 한 많은 상청액을 스핀 컬럼으로 옮기고 10,000 x g 에서 60초 동안 원심분리합니다. 흐름을 버립니다.
9. 스핀 컬럼을 500μL의 완충액 PB(키트에 포함)로 세척하고 10,000 x g 에서 60초 동안 원심분리기를 사용합니다. 흐름을 버립니다.
10. 750μL의 완충액 PE(키트에 포함)로 스핀 컬럼을 세척하고 10,000 x g 에서 60초 동안 원심분리합니다. 흐름을 버리고 60초 동안 원심분리하여 잔류 버퍼를 제거합니다.
11. 스핀 컬럼을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 20-30 μL의 DNAse- 및 RNAse-free_ddH2O를 스핀 컬럼의 필터에 적용하고 1-2분 동안 방치한 후 10,000 x g 에서 60초 동안 원심분리합니다.
12. 플라스미드 특이적 프라이머(pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGACA)를 사용하여 표준 PCR 반응을 수행하고, 주형 DNA를 제공하는 용출액을 사용합니다. 양성 대조군을 E. coli mini-prep 유래의 플라스미드로 포함시킨다.
    참고: 이 연구에 사용된 PCR 설정은 다음과 같습니다: 98°C에서 5분, (98°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 45초) 30주기, 72°C에서 2분, 4°C 유지. 매개변수는 사용된 중합효소, 단편 길이 및 이 프로토콜을 사용하는 모든 사람이 사용하는 정확한 프라이머에 크게 의존합니다.

결과

혁신 효율성
L. 루테리는 다른 락토바실라과(Lactobacillaceae) ^19,20에서 관찰된 바와 같이 dcm-/dam^- 비메틸화 플라스미드를 필요로 하지 않습니다(그림 1 참조). 8.5kb 플라스미드 pTRKH3_mCherry2(pAMβ1 세타 복제 기점) 10μL를 사용한 L. 루테리 DSM20016의 전기천공법은 플라스미드 메틸화 조건에...

토론

L. 루테리 DSM20016의 형질전환을 위한 가장 중요한 단계는 형질전환이 도금된 후 혐기성 성장 조건의 생성입니다. 호기성 조건에서 얻은 콜로니는 매우 가끔씩만 발생하며 일반적으로 MRS 국물에 접종하면 성장하지 않습니다. 콜로니 성장 가능성을 최대화하기 위해 전체 회수량을 도금하는 것도 연습해야 합니다. 이 두 가지 중요한 단계에도 불구하고, 형질전환 효율은 여전히 실험의 한계이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production