Métodos para Confirmação de Eletroporação e Transformação em Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos para trabalhar com Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detalhando crescimento, transformação plasmidial, PCR de colônias, medição de proteína repórter fluorescente e mini-preparação limitada de plasmídeos, bem como problemas comuns e solução de problemas. Esses protocolos permitem a medição de proteínas repórteres em DSM20016, ou a confirmação via PCR de colônia se nenhum repórter estiver envolvido.

Resumo

Lactobacillus eram um gênero incrivelmente grande e diversificado de bactérias compreendendo 261 espécies, várias das quais eram cepas comensais com potencial para uso como chassi para empreendimentos biológicos sintéticos dentro do trato gastrointestinal. A ampla variação fenotípica e genotípica observada dentro do gênero levou a uma recente reclassificação e à introdução de 23 novos gêneros.

Devido à amplitude das variações dentro dos gêneros antigos, os protocolos demonstrados em um membro podem não funcionar como anunciado com outros membros. A falta de informações centralizadas sobre como manipular exatamente cepas específicas levou a uma série de abordagens ad hoc , muitas vezes adaptadas de outras famílias bacterianas. Isso pode complicar as coisas para os pesquisadores que estão começando na área, que podem não saber quais informações se aplicam ou não à cepa escolhida.

Neste artigo, pretendemos centralizar um conjunto de protocolos com sucesso demonstrado, especificamente na designação F275 da cepa de Limosilactobacillus reuteri (outros números de coleta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), juntamente com conselhos de solução de problemas e problemas comuns que se podem encontrar. Esses protocolos devem permitir que um pesquisador com pouca ou nenhuma experiência trabalhando com DSM20016 de L. reuteri transforme um plasmídeo, confirme a transformação e meça o feedback do sistema em um leitor de placas por meio de uma proteína repórter.

Introdução

O gênero Lactobacillus foi historicamente classificado como gram-positivo, em forma de bastonete, não formador de esporos, anaeróbios facultativos ou microaerófilos que quebram açúcares para produzir principalmente ácido lático¹. Esses critérios frouxos levaram a que Lactobacillus fosse, fenotípica e genotipicamente, um gênero extremamente diverso. Essa ampla categorização resultou na reclassificação do gênero, introduzindo 23 novos gêneros em 2020².

O gênero antigo e mais amplo incluía as principais espécies comensais e probióticas geralmente consideradas seguras (GRAS) para consumo³. A família Lactobacillaceae mantém uma percepção pública de serem "bactérias boas" devido aos muitos benefícios relatados à saúde conferidos pelo consumo de várias cepas 4,5,6,7. A facilidade com que eles podem navegar no trato gastrointestinal⁸ e sua aceitação pública combinam-se para posicionar cepas de Lactobacillaceae como fortes candidatas como organismos de chassi para aplicações medicinais, terapêuticas ou diagnósticas ingeríveis.

A ampla gama de características presentes na família Lactobacillaceae levou a uma situação em que não há de fato uma cepa de organismo-modelo; Os grupos de pesquisa tendem a selecionar espécies com as propriedades mais relevantes para seus objetivos particulares. (Por exemplo, laboratórios de fermentação láctea poderiam escolher L. lactis; estudos de fermentação vegetal poderiam selecionar L. plantarum; pesquisas sobre probióticos poderiam se concentrar em L. acidophilus; e assim por diante.)

Essa mesma ampla gama de características entre as espécies levou a um acúmulo de protocolos e procedimentos que podem funcionar bem para um subconjunto da família Lactobacillaceae , mas requerem otimização para funcionar eficientemente (ou talvez para funcionar) em outros⁹. Essa necessidade de otimização entre membros da família e mesmo dentro de membros da mesma espécie pode frustrar os esforços de pesquisadores desconhecidos. Os protocolos publicados nas seções de métodos dos artigos também podem incluir suas próprias^{modificações10}, levando a coleções de protocolos fragmentadas e descentralizadas.

L. reuteri é considerado um comensal amplamente vertebrado, encontrado consistentemente nos tratos gastrointestinal (GI) de mamíferos, aves¹¹ e peixes¹². As subcepas de L. reuteri são frequentemente geneticamente especializadas, via adaptação de proteínas de adesão do muco, para colonizar mais permanentemente hospedeiros nativos específicos 8,11,13. As espécies de Limosilactobacillus do trato gastrointestinal podem ser isoladas em hospedeiros fora de seu hospedeiro nativo, mas tendem mais para uma natureza transitória⁸.

Devido à especialização humano-hospedeiro, o L. reuteri DSM20016 posiciona-se muito bem como um chassi para aplicações diagnósticas ou terapêuticas em qualquer ponto do trato gastrointestinal humano, e a tensão DSM20016 poderia fornecer uma janela de efeito mais duradoura para intervenções quando comparada a cepas mais transitórias.

Neste artigo, descrevemos uma série de protocolos com eficácia demonstrada em Limosilactobacillus reuteri (designação da cepa: F275; outros números de coleta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), juntamente com informações centralizadas sobre a cepa de outras fontes para auxiliar em aplicações de biologia molecular e de sistemas. Os procedimentos aqui descritos devem permitir que um pesquisador sem experiência prévia em cultura de L. reuteri, crie estoques eletrocompetentes, selecione colônias transformadas, confirme a transformação via reação em cadeia da polimerase (PCR) de colônias e meça a resposta do sistema projetado via proteínas fluorescentes repórteres.

Observamos que protocolos relacionados cobriram a recombinação do genoma assistida por CRISPR-Cas9 em L. reuteri (cepa: ATCC-PTA-6475)¹⁴ e a edição do genoma assistida por nickase CRSIPR-Cas9 em múltiplas colorações não-L. reuteri, da família Lactobacillaceae ^15,16; estes, no entanto, não abordam a cepa L. reuteri DSM20016 que é nosso foco aqui.

Protocolo

1. Preparação de células eletrocompetentes DSM20016 L. reuteri

NOTA: Baseia-se em um protocolo de Berthier et ^al.17, com velocidades de centrifugação informadas por Rattanachaikunsopon et al.^18º.

1. Em um tubo de centrífuga de 50 mL, inocular L. reuteri do estoque de glicerol em 6 mL de caldo deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubar aeróbia durante a noite a 37 °C numa incubadora estática.
2. Na manhã seguinte, inocular 4 mL da cultura noturna em 200 mL de caldo MRS (diluição 1:50).
3. Deixar crescer aerobicamente numa incubadora estática a 37 °C até que o valor de densidade óptica de 600 nm (OD600) atinja 0,5-0,85; Isso deve levar aproximadamente 2-3 h.
4. Assim que um valor OD600 adequado for atingido, decantar o meio em tubos de centrífuga de 50 mL e colocar no gelo enquanto equilibra os tubos.
5. Centrifugar por 5 min a 5.000 x g em uma centrífuga pré-resfriada a 4 °C.
6. Descarte o sobrenadante, ressuspenda cada pastilha em 50 mL de ddH₂O pré-resfriado (0 °C a 4 °C) e centrifugue novamente com as mesmas configurações da etapa anterior. Mantenha as células no gelo tanto quanto possível.
7. Repita a etapa 1.6.
8. Ressuspender cada pellet em 25 mL de ddH₂O: sacarose 0,5 M, glicerol a 10%. Centrifugar a 5.000 x g a 4 °C por 10 min. Descarte o sobrenadante e coloque as células novamente no gelo.
9. Ressuspender todos os pellets nos mesmos 2 mL de ddH₂O: sacarose 0,5 M, glicerol a 10%.
10. Alíquota em porções de 50 μL a 100 μL em tubos de microcentrífuga pré-resfriados; conservar a -80 °C para utilização posterior.

2. Eletroporação de L. reuteri

NOTA: Evite pipetar tanto quanto possível nas etapas a seguir. A inclusão de uma eletroporação controle, sem adição de plasmídeo, é aconselhada para garantir que a seleção de antibióticos seja adequada.

1. Pegue uma alíquota de L. reuteri eletrocompetente inteira e descongele-a no gelo.
2. Misturar suavemente 5 μL a 10 μL de plasmídeo (concentração final de plasmídio >6 nM) na alíquota descongelada, evitando ao máximo a pipetagem.
3. Transfira para uma cubeta de eletroporação gelada de 1 mm de folga.
4. Eletroporato a 1,25 kV, 400 Ω e 25 μF.
5. Adicione 1 mL de caldo MRS à temperatura ambiente (TR) e misture invertendo a cubeta uma ou duas vezes.
6. Coloque as cubetas em uma incubadora estática a 37 °C por 2,5-3 h para permitir a recuperação.
7. Plaquear toda a quantidade em várias placas de ágar MRS com seleção apropriada.
8. Coloque os pratos dentro de um recipiente completamente hermético com uma pequena vela acesa ("tealight") e um sachê gerador de atmosfera anaeróbica.
9. Crescer a 37 °C por 2-3 dias ou até que colônias visíveis estejam presentes.

3. Medição da proteína repórter fluorescente resistente a ácidos mCherry2

1. Escolha as colônias necessárias para a medição e inocular em uma microplaca de armazenamento de 96 poços com 1,5 mL de caldo MRS esterilizado por filtro (não autoclavado) por poço e um antibiótico de seleção apropriado.
2. Incubar aeróbia durante 24 h durante a noite a 37 °C sem agitar.
   NOTA: Esta microplaca de armazenamento deve ser mantida para utilização na secção 4 (PCR de colónias).
3. L. reuteri precipitar-se-á para fora da mídia quando na fase estacionária; ressuspender a cultura durante a noite por meio de pipetagem.
4. Transfira 200 μL para uma placa plana, de fundo claro, de 96 poços, transfira a placa para um leitor de placas e meça o DO e a fluorescência de mCherry2 (excitação [Ex]: 589 nm; emissão [Em]: 610 nm) ou outros repórteres relevantes.

4. Confirmação da captação de plasmídeos via PCR de colônias

1. A partir da microplaca de armazenamento de 96 poços da seção 3, transferir 5 μL para um tubo de PCR.
   NOTA: Se >5 min tiverem passado, pode ser necessário ressuspender o L. reuteri uma segunda vez.
2. Em uma microcentrífuga portátil de bancada, gire para baixo até que o pellet possa ser visto (aproximadamente 2 min a 2.000 x g), descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 20 μL de NaOH 20 mM.
3. Ferva a 95 °C por 5 min, vórtice, e repita a fervura uma segunda vez.
4. Resfriar imediatamente as amostras; tente manter as amostras no gelo tanto quanto possível nas etapas a seguir para diminuir a probabilidade de degradação do molde e inibição da PCR.
5. Gire para baixo em uma microcentrífuga portátil de bancada a 2.000 x g por 2 min até que os restos celulares sejam peletizados, em seguida, pegue 1 μL do sobrenadante e dilua em 99 μL de ddH₂O sem DNase e RNase gelada (diluição de 100x).
6. Use a diluição de 100x como o DNA molde em uma reação de PCR padrão usando primers plasmidiais específicos. Incluir um controle positivo com um plasmídeo derivado da mini-preparação de E. coli.
7. Devolver as amostras no gelo e adicionar um corante de carga adequado a uma concentração de 1x.
8. Executar em gel de agarose a 1% em tampão TAE (ácido tris-acetato-etilenodiaminotetracético [EDTA]) a 110 V durante 30 minutos. Imagem se necessário.

5. Mini-prep para L. reuteri , seguido de PCR para confirmar a presença plasmidial

NOTA: Protocolo destinado ao uso com o kit mini-prep listado na Tabela de Materiais.

1. Inocular L. reuteri em 10 mL de caldo MRS contendo um antibiótico apropriado e incubar durante a noite aeróbia a 37 °C em uma incubadora estática.
2. Centrifugar a 5.000 x g por 10 min em centrífuga pré-resfriada a 4 °C.
3. Lavar o pellet em 2 mL de tampão P1 padrão (incluído no kit) para anular a acidez que possa interferir nas etapas posteriores, centrifugar com a mesma configuração descrita anteriormente e descartar o sobrenadante.
4. Ressuspender o pellet em 250 μL de tampão P1 modificado contendo 10 mg/mL de lisozima e 100 U/mL de mutanolisina para lisar as células bacterianas. Incubar durante 1-2 h a 37 °C.
5. Adicionar 250 μL de tampão P2, misturar invertendo quatro a seis vezes e incubar em TR por um período não superior a 5 min.
6. Adicione 350 μL de tampão N3 (incluído com o kit) e inverta imediatamente quatro a seis vezes suavemente para misturar.
7. Centrifugar a 10.000 x g por 10 min.
8. Transfira o máximo de sobrenadante possível para uma coluna de spin e centrífuga a 10.000 x g por 60 s. Descarte o fluxo.
9. Lavar a coluna de spin com 500 μL de tampão PB (incluído no kit) e centrifugar a 10.000 x g por 60 s. Descarte o fluxo.
10. Lave a coluna de spin com 750 μL de PE tampão (incluído no kit) e centrifuja a 10.000 x g por 60 s. Descarte o fluxo e centrifugue por 60 s para remover qualquer buffer residual.
11. Coloque a coluna de spin num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Aplicar 20-30 μL de ddH₂O livre de DNAse e RNAse no filtro da coluna de spin e deixar por 1-2 min, antes de centrifugar a 10.000 x g por 60 s.
12. Realizar uma reação de PCR padrão usando primers plasmidiais específicos (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), com eluato fornecendo o DNA molde. Incluir um controle positivo com um plasmídeo derivado da mini-preparação de E. coli.
    NOTA: As configurações de PCR usadas neste estudo são: 98 °C por 5 min, (98 °C por 30 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por 45 s) 30 ciclos, 72 °C por 2 min, 4 °C segurar. Os parâmetros são altamente dependentes da polimerase utilizada, do comprimento do fragmento e dos primers exatos utilizados por qualquer pessoa que utilize este protocolo.

Resultados

Eficiências de transformação
L. reuteri não necessita de plasmídeo dcm-/dam^- não metilado, como observado para outras Lactobacillaceae^19,20 (ver Figura 1). A eletroporação de DSM20016 de L. reuteri com 10 μL do pTRKH3_mCherry2 plasmidial de 8,5 kb (pAMβ1 origem da replicação) deve proporcionar eficiências de transformação de aproximadamente 80 unidade...

Discussão

A etapa mais crítica para a transformação da DSM20016 de L. reuteri é a geração de condições de crescimento anaeróbio após as transformações serem plaqueadas; colônias adquiridas em condições aeróbicas são muito ocasionais e geralmente não crescem quando inoculadas em caldo MRS. O chapeamento de todo o volume de recuperação também deve ser praticado para maximizar a probabilidade de crescimento da colônia. Mesmo com essas duas etapas críticas, a eficiência da transformação ainda é uma ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production