Métodos para la electroporación y confirmación de transformación en Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Resumen

Aquí, presentamos protocolos para trabajar con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detallando el crecimiento, la transformación de plásmidos, la PCR de colonias, la medición de proteínas reporteras fluorescentes y la mini-preparación limitada de plásmidos, así como problemas comunes y solución de problemas. Estos protocolos permiten la medición de proteínas reporteras en DSM20016, o la confirmación a través de PCR de colonias si no hay ningún informador involucrado.

Resumen

Lactobacillus era un género increíblemente grande y diverso de bacterias que comprendía 261 especies, varias de las cuales eran cepas comensales con el potencial de su uso como chasis para esfuerzos biológicos sintéticos dentro del tracto gastrointestinal. La amplia variación fenotípica y genotípica observada dentro del género condujo a una reciente reclasificación y la introducción de 23 nuevos géneros.

Debido a la amplitud de las variaciones dentro de los géneros antiguos, los protocolos demostrados en un miembro pueden no funcionar como se anuncia con otros miembros. La falta de información centralizada sobre cómo manipular exactamente cepas específicas ha llevado a una serie de enfoques ad hoc , a menudo adaptados de otras familias bacterianas. Esto puede complicar las cosas para los investigadores que comienzan en el campo, que pueden no saber qué información se aplica o no a la cepa elegida.

En este documento, nuestro objetivo es centralizar un conjunto de protocolos con éxito demostrado, específicamente en la designación de cepa Limosilactobacillus reuteri F275 (otros números de colección: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), junto con consejos de solución de problemas y problemas comunes que uno puede encontrar. Estos protocolos deberían permitir a un investigador con poca o ninguna experiencia trabajando con L. reuteri DSM20016 transformar un plásmido, confirmar la transformación y medir la retroalimentación del sistema en un lector de placas a través de una proteína reportera.

Introducción

El género Lactobacillus se clasificó históricamente como grampositivo, en forma de bastoncillos, no formadores de esporas, anaerobios facultativos o microaerófilos que descomponen los azúcares para producir principalmente ácido láctico¹. Estos criterios sueltos llevaron a Lactobacillus a ser, fenotípica y genotípicamente, un género extremadamente diverso. Esta amplia categorización dio lugar a la reclasificación del género, introduciendo 23 nuevos géneros en 2020².

El género antiguo, más amplio, incluía las principales especies comensales y probióticas generalmente consideradas seguras (GRAS) para el consumo³. La familia Lactobacillaceae mantiene una percepción pública de ser "bacterias buenas" debido a muchos beneficios para la salud reportados otorgados a través del consumo de varias cepas 4,5,6,7. La facilidad con la que pueden navegar por el tracto gastrointestinal⁸ y su aceptación pública se combinan para posicionar a las cepas de Lactobacillaceae como candidatos fuertes como organismos de chasis para aplicaciones medicinales, terapéuticas o de diagnóstico ingeribles.

La amplia gama de características presentes dentro de la familia Lactobacillaceae ha llevado a una situación en la que no existe una cepa de organismo modelo de facto; Los grupos de investigación han tendido a seleccionar las especies con las propiedades más relevantes para sus objetivos particulares. (Por ejemplo, los laboratorios de fermentación láctea podrían elegir L. lactis; los estudios de fermentación vegetal podrían seleccionar L. plantarum; la investigación sobre probióticos podría centrarse en L. acidophilus; y así sucesivamente).

Esta misma amplia gama de características entre especies ha llevado a una acumulación de protocolos y procedimientos que pueden funcionar bien para un subconjunto de la familia Lactobacillaceae , pero requieren optimización para funcionar eficientemente (o tal vez para funcionar en absoluto) en otros⁹. Esta necesidad de optimización entre los miembros de la familia e incluso dentro de los miembros de la misma especie puede frustrar los esfuerzos de investigadores desconocidos. Los protocolos publicados en las secciones de métodos de los documentos también pueden incluir sus propias modificaciones¹⁰, lo que lleva a colecciones de protocolos fragmentadas y descentralizadas.

L. reuteri se considera un comensal ampliamente vertebrado, que se encuentra consistentemente en los tractos gastrointestinales (GI) de mamíferos, aves¹¹ y peces¹². Las subcepas de L. reuteri a menudo están genéticamente especializadas, a través de la adaptación de proteínas de adhesión al moco, para colonizar de forma más permanente huéspedes nativos específicos 8,11,13. Las especies de Limosilactobacillus del tracto gastrointestinal pueden aislarse en huéspedes fuera de su huésped nativo, pero tienden más hacia una naturaleza transitoria⁸.

Debido a la especialización humano-huésped, L. reuteri se DSM20016 posiciona muy bien como un chasis para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas en cualquier punto del tracto gastrointestinal humano, y la DSM20016 de la cepa podría proporcionar una ventana de efecto más duradera para las intervenciones en comparación con cepas más transitorias.

En este documento, describimos una serie de protocolos con efectividad demostrada en Limosilactobacillus reuteri (designación de cepa: F275; otros números de colección: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), junto con información centralizada sobre la cepa de otras fuentes para ayudar en aplicaciones de biología molecular y de sistemas. Los procedimientos establecidos en este documento deben permitir a un investigador sin experiencia previa para cultivar L. reuteri, crear existencias electrocompetentes, seleccionar colonias transformadas, confirmar la transformación a través de la reacción en cadena de la polimerasa de colonias (PCR) y medir la respuesta del sistema diseñado a través de proteínas reporteras fluorescentes.

Observamos que los protocolos relacionados han cubierto la recombinación del genoma de ssDNA asistida por CRISPR-Cas9 en L. reuteri (cepa: ATCC-PTA-6475)14, y la edición del genoma asistida por nickasa CRSIPR-Cas9 en múltiples tinciones de la familia Lactobacillaceae no L. ^15,16; sin embargo, estos no abordan la cepa de L. reuteri DSM20016 que es nuestro enfoque aquí.

Protocolo

1. Preparación de células electrocompetentes de L. reuteri DSM20016

NOTA: Esto se basa en un protocolo de Berthier et ^al.17, con velocidades de centrifugación informadas por Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. En un tubo de centrífuga de 50 ml, inocular L. reuteri de la cal de glicerol en 6 ml de caldo deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubar aeróbicamente durante la noche a 37 °C en una incubadora estática.
2. A la mañana siguiente, inocular 4 ml del cultivo nocturno en 200 ml de caldo MRS (dilución 1:50).
3. Permitir que crezca aeróbicamente en una incubadora estática de 37 °C hasta que el valor de densidad óptica de 600 nm (OD600) alcance 0.5-0.85; Esto debería tomar aproximadamente 2-3 h.
4. Tan pronto como se alcance un valor adecuado de OD600, decantar el medio en tubos de centrífuga de 50 ml y colóquelos en hielo mientras equilibra los tubos.
5. Centrifugar durante 5 min a 5.000 x g en una centrífuga preenfriada a 4 °C.
6. Desechar el sobrenadante, resuspender cada pellet en 50 ml de_ddH2Opreenfriado (0 °C a 4 °C) y centrifugar de nuevo con los mismos ajustes que el paso anterior. Mantenga las células en hielo tanto como sea posible.
7. Repita el paso 1.6.
8. Resuspender cada pellet en 25 mL de_ddH2O: 0,5 M sacarosa, 10% glicerol. Centrifugar a 5.000 g a 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a poner las células en hielo.
9. Resuspender todos los pellets en los mismos 2 mL de_ddH2O:0,5 M de sacarosa, 10% glicerol.
10. Alícuota en porciones de 50 μL a 100 μL en tubos de microcentrífuga prerefrigerados; conservar a -80 °C para su uso posterior.

2. Electroporación de L. reuteri

NOTA: Evite el pipeteo tanto como sea posible en los siguientes pasos. Se recomienda la inclusión de una electroporación de control, sin plásmido añadido, para garantizar que la selección de antibióticos sea adecuada.

1. Tome una alícuota electrocompetente entera de L. reuteri y descongele en hielo.
2. Mezclar suavemente de 5 μL a 10 μL de plásmido (concentración final de plásmidos >6 nM) en la alícuota descongelada, evitando el pipeteo tanto como sea posible.
3. Transfiera a una cubeta de electroporación de 1 mm de espacio frío por hielo.
4. Electroporato a 1,25 kV, 400 Ω y 25 μF.
5. Agregue 1 ml de caldo MRS a temperatura ambiente (RT) y mezcle invirtiendo la cubeta una o dos veces.
6. Coloque las cubetas en una incubadora estática a 37 °C durante 2,5-3 h para permitir la recuperación.
7. Coloque la cantidad total en múltiples placas de agar MRS con la selección adecuada.
8. Coloque los platos dentro de un recipiente completamente hermético con una pequeña vela encendida ("luz de té") y un sobre anaeróbico generador de atmósfera.
9. Cultivar a 37 °C durante 2-3 días o hasta que haya colonias visibles.

3. Medición de la proteína reportera fluorescente resistente a los ácidos mCherry2

1. Elija las colonias necesarias para la medición e inocular en una microplaca de almacenamiento de 96 pocillos con 1,5 ml de caldo MRS esterilizado por filtro (no esterilizado en autoclave) por pocillo y un antibiótico de selección apropiado.
2. Incubar aeróbicamente durante 24 h durante la noche a 37 °C sin agitar.
   NOTA: Esta microplaca de almacenamiento debe conservarse para su uso en la sección 4 (PCR de colonias).
3. L. reuteri se precipitará fuera de los medios cuando esté en la fase estacionaria; Resuspender el cultivo nocturno mediante pipeteo.
4. Transfiera 200 μL a una placa plana, de fondo transparente y de 96 pocillos, transfiera la placa a un lector de placas y mida el OD y la fluorescencia de mCherry2 (excitación [Ej]: 589 nm; emisión [Em]: 610 nm) u otros reporteros relevantes.

4. Confirmación de la captación de plásmidos mediante PCR de colonias

1. Desde la microplaca de almacenamiento de 96 pocillos de la sección 3, transfiera 5 μL a un tubo de PCR.
   NOTA: Si han pasado >5 minutos, puede ser necesario volver a suspender el L. reuteri por segunda vez.
2. En una microcentrífuga portátil de sobremesa, gire hacia abajo hasta que se pueda ver el pellet (aproximadamente 2 min a 2,000 x g), deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 20 μL de NaOH de 20 mM.
3. Hervir a 95 °C durante 5 min, vórtice, y repetir el hervor una segunda vez.
4. Enfriar inmediatamente las muestras; trate de mantener las muestras en hielo tanto como sea posible en los siguientes pasos para reducir la probabilidad de degradación de la plantilla y la inhibición de la PCR.
5. Girar en una microcentrífuga portátil de sobremesa a 2.000 x g durante 2 minutos hasta que los restos celulares estén granulados, luego tomar 1 μL del sobrenadante y diluir en 99 μL de ddH₂O sin DNasa y RNasa heladas (dilución 100x).
6. Utilice la dilución 100x como ADN plantilla en una reacción de PCR estándar utilizando cebadores específicos de plásmidos. Incluir un control positivo con un plásmido derivado de la mini-preparación de E. coli.
7. Devuelva las muestras en hielo y agregue un tinte de carga apropiado a una concentración de 1x.
8. Ejecutar en gel de agarosa al 1% en tampón TAE (ácido tris-acetato-etilendiaminotetraacético [EDTA]) a 110 V durante 30 min. Imagen si es necesario.

5. Protocolo de mini-preparación para L. reuteri , seguido de PCR para confirmar la presencia de plásmidos

NOTA: Protocolo diseñado para su uso con el kit de mini-preparación que figura en la Tabla de materiales.

1. Inocular L. reuteri en 10 ml de caldo MRS que contenga un antibiótico apropiado e incubar aeróbicamente durante la noche a 37 °C en una incubadora estática.
2. Centrifugadora a 5.000 g durante 10 min en una centrífuga preenfriada a 4 °C.
3. Lave el pellet en 2 ml de tampón P1 estándar (incluido con el kit) para anular la acidez que pueda interferir con los pasos posteriores, centrifugar con la misma configuración descrita anteriormente y desechar el sobrenadante.
4. Resuspender el pellet en 250 μL de tampón P1 modificado que contenga 10 mg/ml de lisozima y 100 U/ml de mutanolisina para lisar las células bacterianas. Incubar durante 1-2 h a 37 °C.
5. Añadir 250 μL de tampón P2, mezclar invirtiendo de cuatro a seis veces e incubar a RT durante no más de 5 min.
6. Agregue 350 μL de tampón N3 (incluido con el kit) e invierta inmediatamente de cuatro a seis veces suavemente para mezclar.
7. Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min.
8. Transfiera la mayor cantidad posible de sobrenadante a una columna de centrifugado y centrífuga a 10.000 x g durante 60 s. Deseche el flujo a través.
9. Lavar la columna de centrifugado con 500 μL de PB tampón (incluido con el kit) y centrifugar a 10.000 x g durante 60 s. Deseche el flujo a través.
10. Lave la columna de centrifugado con 750 μL de PE tampón (incluido con el kit) y centrifugar a 10.000 x g durante 60 s. Deseche el flujo y centrifugar durante 60 s para eliminar cualquier tampón residual.
11. Coloque la columna de centrifugado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Aplicar 20-30 μL de_ddH2Olibre de ADN y RNAsa al filtro de la columna de centrifugado y dejar actuar durante 1-2 min, antes de centrifugar a 10.000 x g durante 60 s.
12. Realice una reacción de PCR estándar utilizando cebadores específicos de plásmidos (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), con eluido que proporciona el ADN modelo. Incluir un control positivo con un plásmido derivado de la mini-preparación de E. coli.
    NOTA: Los ajustes de PCR utilizados en este estudio son: 98 °C durante 5 min, (98 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s, 72 °C durante 45 s) 30 ciclos, 72 °C durante 2 min, 4 °C de retención. Los parámetros dependen en gran medida de la polimerasa utilizada, la longitud del fragmento y los cebadores exactos utilizados por cualquier persona que utilice este protocolo.

Resultados

Eficiencias de transformación
L. reuteri no requiere un plásmido no metilado ^dcm-/dam, como se observa para otras Lactobacillaceae^19,20 (ver Figura 1). La electroporación de L. reuteri DSM20016 con 10 μL del plásmido de 8,5 kb pTRKH3_mCherry2 (origen de replicación theta pAMβ1) debe dar eficiencias de transformación de aproximadamente 80 unidades formadoras ...

Discusión

El paso más crítico para la transformación de L. reuteri DSM20016 es la generación de condiciones de crecimiento anaeróbico después de que las transformaciones son plateadas; Las colonias obtenidas en condiciones aeróbicas son muy ocasionales y generalmente no crecen cuando se inoculan en caldo MRS. También se debe practicar el recubrimiento de todo el volumen de recuperación para maximizar la probabilidad de crecimiento de la colonia. Incluso con estos dos pasos críticos, la eficiencia de la transform...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production