Méthodes d’électroporation et de confirmation de transformation chez Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Résumé

Ici, nous présentons des protocoles pour travailler avec Limosilactobacillus reuteri DSM20016, détaillant la croissance, la transformation plasmidique, la PCR de colonie, la mesure de protéines rapporteures fluorescentes et la mini-préparation plasmidique limitée, ainsi que les problèmes courants et le dépannage. Ces protocoles permettent la mesure des protéines rapporteures dans DSM20016, ou la confirmation par PCR de colonie si aucun rapporteur n’est impliqué.

Résumé

Lactobacillus était un genre incroyablement grand et diversifié de bactéries comprenant 261 espèces, dont plusieurs étaient des souches commensales avec le potentiel d’être utilisé comme châssis pour des activités biologiques synthétiques dans le tractus gastro-intestinal. La grande variation phénotypique et génotypique observée au sein du genre a conduit à une reclassification récente et à l’introduction de 23 nouveaux genres.

En raison de l’ampleur des variations au sein des anciens genres, les protocoles démontrés chez un membre peuvent ne pas fonctionner comme annoncé avec d’autres membres. Un manque d’informations centralisées sur la façon exacte de manipuler des souches spécifiques a conduit à une gamme d’approches ad hoc , souvent adaptées à partir d’autres familles bactériennes. Cela peut compliquer les choses pour les chercheurs qui débutent dans le domaine, qui peuvent ne pas savoir quelle information s’applique ou non à la souche choisie.

Dans cet article, nous visons à centraliser un ensemble de protocoles dont le succès a été démontré, en particulier dans la désignation de la souche Limosilactobacillus reuteri F275 (autres numéros de collection: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), ainsi que des conseils de dépannage et des problèmes courants que l’on peut rencontrer. Ces protocoles devraient permettre à un chercheur ayant peu ou pas d’expérience de travail avec L. reuteri DSM20016 de transformer un plasmide, de confirmer la transformation et de mesurer la rétroaction du système dans un lecteur de plaques via une protéine rapporteur.

Introduction

Le genre Lactobacillus a été historiquement classé comme gram-positif, en forme de bâtonnet, non sporulé, anaérobie facultatif ou microaérophiles qui décomposent les sucres pour produire principalement de l’acide lactique¹. Ces critères vagues ont conduit à Lactobacillus étant, phénotypiquement et génotypiquement, un genre extrêmement diversifié. Cette vaste catégorisation a entraîné la reclassification du genre, introduisant 23 nouveaux genres en 2020².

L’ancien genre, plus large, comprenait les principales espèces commensales et probiotiques généralement considérées comme sûres (GRAS) pour la consommation³. La famille des lactobacillacées maintient une perception publique d’être de « bonnes bactéries » en raison de nombreux avantages pour la santé rapportés conférés par la consommation de diverses souches 4,5,6,7. La facilité avec laquelle ils peuvent naviguer dans le tractus gastro-intestinal⁸ et leur acceptation par le public se combinent pour positionner les souches de Lactobacillaceae comme des candidats solides en tant qu’organismes de châssis pour des applications médicinales, thérapeutiques ou diagnostiques ingérables.

Le large éventail de caractéristiques présentes dans la famille des Lactobacillaceae a conduit à une situation dans laquelle il n’y a pas de souche d’organisme modèle de facto ; Les groupes de recherche ont eu tendance à sélectionner les espèces dont les propriétés correspondent le mieux à leurs objectifs particuliers. (Par exemple, les laboratoires de fermentation laitière pourraient choisir L. lactis; les études sur la fermentation végétale pourraient sélectionner L. plantarum; la recherche sur les probiotiques pourrait se concentrer sur L. acidophilus; et ainsi de suite.)

Ce même large éventail de caractéristiques à travers les espèces a conduit à une accumulation de protocoles et de procédures qui peuvent bien fonctionner pour un sous-ensemble de la famille des Lactobacillaceae , mais nécessitent une optimisation pour fonctionner efficacement (ou peut-être pour fonctionner du tout) dans d’autres⁹. Ce besoin d’optimisation entre les membres de la famille et même au sein des membres d’une même espèce peut contrecarrer les efforts de chercheurs inconnus. Les protocoles publiés dans les sections méthodes des articles peuvent également inclure leurs propres modifications¹⁰, ce qui conduit à des collections de protocoles fragmentées et décentralisées.

L. reuteri est considéré comme un commensal largement vertébré, présent de manière constante dans les voies gastro-intestinales (GI) des mammifères, des oiseaux¹¹ et des poissons¹². Les sous-souches de L. reuteri sont souvent génétiquement spécialisées, par adaptation de la protéine d’adhésion du mucus, pour coloniser de façon plus permanente des hôtes indigènes spécifiques 8,11,13. Les espèces de Limosilactobacillus peuvent être isolées chez des hôtes en dehors de leur hôte indigène, mais tendent davantage vers une nature transitoire⁸.

En raison de la spécialisation homme-hôte, L. reuteri se positionne DSM20016 très bien comme un châssis pour des applications diagnostiques ou thérapeutiques à n’importe quel point du tractus gastro-intestinal humain, et la souche DSM20016 pourrait fournir une fenêtre d’effet plus durable pour les interventions par rapport aux souches plus transitoires.

Dans cet article, nous décrivons une série de protocoles dont l’efficacité a été démontrée chez Limosilactobacillus reuteri (désignation de la souche : F275 ; autres numéros de collection : DSM20016, ATCC23272 CIP109823), ainsi que des informations centralisées sur la souche provenant d’autres sources pour faciliter les applications de biologie moléculaire et systémique. Les procédures décrites dans le présent document devraient permettre à un chercheur sans expérience préalable de cultiver L. reuteri des stocks électrocompétents, de sélectionner des colonies transformées, de confirmer la transformation par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) et de mesurer la réponse du système conçu au moyen de protéines rapporteures fluorescentes.

Nous notons que des protocoles connexes ont couvert la recombinaison du génome de l’ADNss assistée par CRISPR-Cas9 chez L. reuteri (souche : ATCC-PTA-6475)14, et l’édition du génome assistée par la nickase CRSIPR-Cas9 dans plusieurs colorations de la famille des Lactobacillaceae non L. reuteri ^15,16 ; ceux-ci ne traitent toutefois pas de la souche DSM20016 L. reuteri sur laquelle nous nous concentrons ici.

Protocole

1. Préparation de cellules électrocompétentes DSM20016 L. reuteri

NOTE: Ceci est basé sur un protocole de Berthier et ^al.17, avec des vitesses de centrifugation informées par Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. Dans un tube à centrifuger de 50 mL, inoculer L. reuteri à partir d’un stock de glycérol dans 6 mL de bouillon deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incuber en aérobiose pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur statique.
2. Le lendemain matin, inoculer 4 mL de la culture de nuit dans 200 mL de bouillon MRS (dilution de 1:50).
3. Laisser croître en aérobie dans un incubateur statique à 37 °C jusqu’à ce que la valeur de densité optique de 600 nm (OD600) atteigne 0,5-0,85; Cela devrait prendre environ 2-3 h.
4. Dès qu’une valeur adéquate de OD600 est atteinte, décanter le média dans des tubes à centrifuger de 50 ml et placer sur de la glace tout en équilibrant les tubes.
5. Centrifuger pendant 5 min à 5 000 x g dans une centrifugeuse préréfrigérée à 4 °C.
6. Jeter le surnageant, remettre chaque pastille en suspension dans 50 mL de_ddH2Oprérefroidi (0 °C à 4 °C) et centrifuger à nouveau avec les mêmes réglages que l’étape précédente. Gardez les cellules sur la glace autant que possible.
7. Répétez l’étape 1.6.
8. Remettez chaque pastille en suspension dans 25 mL de_ddH2O: 0,5 M de saccharose, 10 % de glycérol. Centrifuger à 5 000 x g à 4 °C pendant 10 min. Jetez le surnageant et remettez les cellules sur la glace.
9. Remettez toutes les pastilles en suspension dans les mêmes 2 mL de_ddH2O: 0,5 M de saccharose, 10 % de glycérol.
10. Aliquote en portions de 50 μL à 100 μL dans des tubes microcentrifugés prérefroidis; Conserver à -80 °C pour une utilisation ultérieure.

2. Électroporation de L. reuteri

REMARQUE: Évitez de pipeter autant que possible dans les étapes suivantes. L’inclusion d’une électroporation témoin, sans plasmide ajouté, est conseillée pour s’assurer que la sélection des antibiotiques est adéquate.

1. Prenez une aliquote de L. reuteri électrocompétente entière et décongelez-la sur de la glace.
2. Mélanger délicatement 5 μL à 10 μL de plasmide (concentration plasmidique finale >6 nM) dans l’aliquote décongelée, en évitant autant que possible de pipeter.
3. Transférer dans une cuvette d’électroporation glacée de 1 mm.
4. Électroporate à 1,25 kV, 400 Ω et 25 μF.
5. Ajouter 1 mL de bouillon MRS à température ambiante (RT) et mélanger en retournant la cuvette une ou deux fois.
6. Placer les cuvettes dans un incubateur statique à 37 °C pendant 2,5 à 3 h pour permettre la récupération.
7. Plaquer la quantité entière sur plusieurs plaques de gélose MRS avec la sélection appropriée.
8. Placez les assiettes dans un récipient complètement hermétique avec une petite bougie allumée (« tealight ») et un sachet générateur d’atmosphère anaérobie.
9. Cultiver à 37 °C pendant 2-3 jours ou jusqu’à ce que des colonies visibles soient présentes.

3. Mesure de la protéine rapporteur fluorescente résistante aux acides mCherry2

1. Prélever toutes les colonies nécessaires à la mesure et inoculer dans une microplaque de stockage de 96 puits avec 1,5 mL de bouillon MRS stérilisé par filtre (non autoclavé) par puits et un antibiotique de sélection approprié.
2. Incuber en aérobiose pendant 24 h pendant la nuit à 37 °C sans agiter.
   NOTE: Cette microplaque de stockage doit être conservée pour être utilisée dans la section 4 (PCR de colonie).
3. L. reuteri précipite hors du milieu lorsqu’il est en phase stationnaire; Resuspendre la culture de nuit par pipetage.
4. Transférer 200 μL dans une plaque plane à fond clair de 96 puits, transférer la plaque dans un lecteur de plaque et mesurer la DO et la fluorescence de mCherry2 (excitation [Ex] : 589 nm; émission [Em] : 610 nm) ou d’autres déclarants pertinents.

4. Confirmation de l’absorption plasmidique par PCR des colonies

1. À partir de la microplaque de stockage de 96 puits de la section 3, transférer 5 μL dans un tube PCR.
   NOTE: Si >5 minutes se sont écoulées, il peut être nécessaire de remettre en suspension le L. reuteri une deuxième fois.
2. Dans une microcentrifugeuse portative de paillasse, faire tourner vers le bas jusqu’à ce que la pastille soit visible (environ 2 min à 2 000 x g), jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 20 μL de NaOH 20 mM.
3. Faire bouillir à 95 °C pendant 5 min, vortex, et répéter l’ébullition une deuxième fois.
4. Refroidir immédiatement les échantillons; essayez de garder les échantillons sur la glace autant que possible dans les étapes suivantes pour réduire la probabilité de dégradation du gabarit et d’inhibition de la PCR.
5. Faites tourner dans une microcentrifugeuse portative de paillasse à 2 000 x g pendant 2 minutes jusqu’à ce que les débris cellulaires soient enrobés, puis prenez 1 μL du surnageant et diluez dans 99 μL de DNase et de RNase glacés ddH₂O (dilution 100x).
6. Utilisez la dilution 100x comme ADN modèle dans une réaction PCR standard à l’aide d’amorces spécifiques au plasmide. Inclure un témoin positif avec un plasmide dérivé de la mini-préparation E. coli.
7. Remettre les échantillons sur de la glace et ajouter un colorant de chargement approprié à une concentration de 1x.
8. Introduire dans du gel d’agarose à 1 % dans un tampon TAE (acide tris-acétate-éthylènediaminetétraacétique [EDTA]) à 110 V pendant 30 min. Image si nécessaire.

5. Protocole de mini-préparation pour L. reuteri , suivi d’une PCR pour confirmer la présence de plasmides

REMARQUE : Protocole destiné à être utilisé avec la trousse de mini-préparation indiquée dans le tableau des matières.

1. Inoculer L. reuteri dans 10 mL de bouillon MRS contenant un antibiotique approprié et incuber pendant une nuit en aérobie à 37 °C dans un incubateur statique.
2. Centrifuger à 5 000 x g pendant 10 min dans une centrifugeuse pré-réfrigérée à 4 °C.
3. Laver la pastille dans 2 mL de tampon P1 standard (inclus avec la trousse) afin d’éliminer l’acidité qui peut interférer avec les étapes ultérieures, centrifuger avec le même réglage que décrit précédemment et jeter le surnageant.
4. Resuspendre la pastille dans 250 μL de tampon P1 modifié contenant 10 mg/mL de lysozyme et 100 U/mL de mutanolysine afin de lyser les cellules bactériennes. Incuber pendant 1-2 h à 37 °C.
5. Ajouter 250 μL de tampon P2, mélanger en retournant quatre à six fois et incuber à TA pendant 5 minutes au maximum.
6. Ajouter 350 μL de tampon N3 (inclus avec le kit) et retourner immédiatement quatre à six fois doucement pour mélanger.
7. Centrifuger à 10 000 x g pendant 10 min.
8. Transférer autant de surnageant que possible dans une colonne de rotation et centrifuger à 10 000 x g pendant 60 s. Ignorez le flux.
9. Lavez la colonne d’essorage avec 500 μL de tampon PB (inclus avec le kit) et centrifugez à 10 000 x g pendant 60 s. Ignorez le flux.
10. Lavez la colonne d’essorage avec 750 μL de tampon PE (inclus avec le kit) et centrifugez à 10 000 x g pendant 60 s. Éliminer l’écoulement continu et centrifuger pendant 60 s pour éliminer tout tampon résiduel.
11. Placer la colonne d’essorage dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Appliquer 20 à 30 μL de ddH2O sans ADN et ARNase sur le filtrede la colonne de spin et laisser reposer 1 à 2 min, avant de centrifuger à 10 000 x g pendant 60 s.
12. Effectuer une réaction PCR standard à l’aide d’amorces spécifiques au plasmide (pTRKH3_pTUSeq_F : CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R : CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), l’éluat fournissant l’ADN modèle. Inclure un témoin positif avec un plasmide dérivé de la mini-préparation E. coli.
    NOTE: Les paramètres de PCR utilisés dans cette étude sont les suivants: 98 °C pendant 5 min, (98 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 45 s) 30 cycles, 72 °C pendant 2 min, 4 °C maintien. Les paramètres dépendent fortement de la polymérase utilisée, de la longueur du fragment et des amorces exactes utilisées par toute personne utilisant ce protocole.

Résultats

Efficacité de la transformation
L. reuteri ne nécessite pas de plasmide non méthylé dcm-/dam^-, comme observé pour d’autres Lactobacillaceae^19,20 (voir Figure 1). L’électroporation de L. reuteri DSM20016 avec 10 μL du plasmide de 8,5 kb pTRKH3_mCherry2 (pAMβ1 origine thêta de la réplication) devrait donner des efficacités de transformation d’environ ...

Discussion

L’étape la plus critique pour la transformation de L. reuteri DSM20016 est la génération de conditions de croissance anaérobie après que les transformations ont été plaquées; Les colonies acquises dans des conditions aérobies ne sont que très occasionnelles et ne se développent généralement pas lorsqu’elles sont inoculées dans du bouillon MRS. Le placage de l’ensemble du volume de récupération doit également être pratiqué pour maximiser la probabilité de croissance de la colonie. Même ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production