Metodi per l'elettroporazione e la conferma della trasformazione in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Riepilogo

Qui, presentiamo i protocolli per lavorare con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, dettagliando la crescita, la trasformazione plasmidica, la PCR delle colonie, la misurazione della proteina reporter fluorescente e la mini-preparazione limitata del plasmide, nonché problemi comuni e risoluzione dei problemi. Questi protocolli consentono la misurazione delle proteine reporter in DSM20016, o la conferma tramite colony PCR se nessun reporter è coinvolto.

Abstract

Lactobacillus erano un genere incredibilmente grande e diversificato di batteri comprendente 261 specie, molte delle quali erano ceppi commensali con il potenziale per l'uso come telaio per sforzi biologici sintetici all'interno del tratto gastrointestinale. L'ampia variazione fenotipica e genotipica osservata all'interno del genere ha portato a una recente riclassificazione e all'introduzione di 23 nuovi generi.

A causa dell'ampiezza delle variazioni all'interno dei vecchi generi, i protocolli dimostrati in un membro potrebbero non funzionare come pubblicizzato con altri membri. La mancanza di informazioni centralizzate su come manipolare esattamente ceppi specifici ha portato a una serie di approcci ad hoc , spesso adattati da altre famiglie batteriche. Ciò può complicare le cose per i ricercatori che iniziano sul campo, che potrebbero non sapere quali informazioni si applicano o meno al ceppo scelto.

In questo articolo, miriamo a centralizzare una serie di protocolli con dimostrato successo, in particolare nella designazione del ceppo F275 di Limosilactobacillus reuteri (altri numeri di raccolta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), insieme a consigli per la risoluzione dei problemi e problemi comuni che si possono incontrare. Questi protocolli dovrebbero consentire a un ricercatore con poca o nessuna esperienza di lavoro con L. reuteri DSM20016 di trasformare un plasmide, confermare la trasformazione e misurare il feedback del sistema in un lettore di piastre tramite una proteina reporter.

Introduzione

Il genere Lactobacillus è stato storicamente classificato come gram-positivo, a forma di bastoncello, non sporigeno, anaerobi facoltativi o microaerofili che scompongono gli zuccheri per produrre principalmente acido lattico¹. Questi criteri sciolti hanno portato Lactobacillus ad essere, fenotipicamente e genotipicamente, un genere estremamente diversificato. Questa ampia categorizzazione ha portato alla riclassificazione del genere, introducendo 23 nuovi generi nel 2020².

Il vecchio e più ampio genere comprendeva le principali specie commensali e probiotiche generalmente considerate sicure (GRAS) per il consumo³. La famiglia delle Lactobacillaceae mantiene una percezione pubblica di essere "batteri buoni" a causa di molti benefici per la salute segnalati attraverso il consumo di vari ceppi 4,5,6,7. La facilità con cui possono navigare nel tratto gastrointestinale⁸ e la loro accettazione pubblica si combinano per posizionare i ceppi di Lactobacillaceae come candidati forti come organismi del telaio per applicazioni medicinali, terapeutiche o diagnostiche ingeribili.

L'ampia gamma di caratteristiche presenti all'interno della famiglia delle Lactobacillaceae ha portato ad una situazione in cui non esiste di fatto un ceppo modello-organismo; I gruppi di ricerca hanno teso a selezionare le specie con le proprietà più rilevanti per i loro obiettivi particolari. (Ad esempio, i laboratori di fermentazione lattiero-casearia potrebbero scegliere L. lactis; gli studi sulla fermentazione vegetale potrebbero selezionare L. plantarum; la ricerca sui probiotici potrebbe concentrarsi su L. acidophilus; e così via.)

Questa stessa vasta gamma di caratteristiche tra le specie ha portato a un accumulo di protocolli e procedure che possono funzionare bene per un sottogruppo della famiglia delle Lactobacillaceae , ma richiedono un'ottimizzazione per funzionare in modo efficiente (o forse per funzionare affatto) in altri⁹. Questa necessità di ottimizzazione tra i membri della famiglia e anche all'interno di membri della stessa specie può vanificare gli sforzi di ricercatori non familiari. I protocolli pubblicati nelle sezioni dei metodi dei documenti possono anche includere le proprie modifiche¹⁰, portando a raccolte di protocolli frammentate e decentralizzate.

L. reuteri è considerato un commensale ampiamente vertebrato, trovato costantemente nei tratti gastrointestinali (GI) di mammiferi, uccelli¹¹ e pesci¹². I sottoceppi di L. reuteri sono spesso geneticamente specializzati, attraverso l'adattamento delle proteine di adesione del muco, per colonizzare in modo più permanente specifici ospiti nativi 8,11,13. Le specie di Limosilactobacillus del tratto gastrointestinale possono essere isolate in ospiti al di fuori del loro ospite nativo, ma tendono più verso una natura transitoria⁸.

A causa della specializzazione uomo-ospite, L. reuteri DSM20016 si posiziona molto bene come telaio per applicazioni diagnostiche o terapeutiche in qualsiasi punto del tratto gastrointestinale umano e il ceppo DSM20016 potrebbe fornire una finestra di effetto più duratura per gli interventi rispetto a ceppi più transitori.

In questo articolo, delineiamo una serie di protocolli con efficacia dimostrata in Limosilactobacillus reuteri (designazione del ceppo: F275; altri numeri di raccolta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), insieme a informazioni centralizzate sul ceppo da altre fonti per aiutare nelle applicazioni di biologia molecolare e dei sistemi. Le procedure qui descritte dovrebbero consentire a un ricercatore senza esperienza precedente di coltura di L. reuteri, creare stock elettrocompetenti, selezionare colonie trasformate, confermare la trasformazione tramite reazione a catena della polimerasi di colonia (PCR) e misurare la risposta del sistema progettato tramite proteine reporter fluorescenti.

Notiamo che i protocolli correlati hanno riguardato la ricombinazione del genoma ssDNA assistito da CRISPR-Cas9 in L. reuteri (ceppo: ATCC-PTA-6475)14 e l'editing del genoma assistito da nickase-CRSIPR-Cas9 in più non-L. reuteri, Lactobacillaceae famiglia colorazioni^15,16; questi, tuttavia, non affrontano il ceppo di L. reuteri DSM20016 che è il nostro obiettivo qui.

Protocollo

1. Preparazione di L. reuteri DSM20016 cellule elettrocompetenti

NOTA: Questo si basa su un protocollo di Berthier et ^al.17, con velocità di centrifugazione informate da Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. In una provetta da centrifuga da 50 ml, inoculare L. reuteri dal brodo di glicerolo in 6 ml di brodo di deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubare aerobicamente durante la notte a 37 °C in un incubatore statico.
2. La mattina seguente, inoculare 4 ml di coltura notturna in 200 ml di brodo MRS (diluizione 1:50).
3. Lasciare crescere aerobicamente in un incubatore statico a 37 °C fino a quando il valore di densità ottica di 600 nm (OD600) raggiunge 0,5-0,85; Questo dovrebbe richiedere circa 2-3 ore.
4. Non appena viene raggiunto un valore OD600 adeguato, decantare il fluido in provette da centrifuga da 50 ml e metterlo su ghiaccio bilanciando i tubi.
5. Centrifugare per 5 minuti a 5.000 x g in una centrifuga pre-raffreddata a 4 °C.
6. Scartare il surnatante, risospendere ogni pellet in 50 ml di ddH₂O pre-raffreddato (da 0 °C a 4 °C) e centrifugare nuovamente con le stesse impostazioni del passaggio precedente. Mantenere le cellule sul ghiaccio il più possibile.
7. Ripetere il passaggio 1.6.
8. Risospendere ogni pellet in 25 ml di ddH₂O: 0,5 M di saccarosio, 10% di glicerolo. Centrifugare a 5.000 x g a 4 °C per 10 min. Scartare il surnatante e rimettere le cellule sul ghiaccio.
9. Risospendere tutti i pellet negli stessi 2 ml di ddH₂O: 0,5 M saccarosio, 10% glicerolo.
10. aliquota in porzioni da 50 μL a 100 μL in provette per microcentrifuga prerefrigerate; conservare a -80 °C per un uso successivo.

2. Elettroporazione di L. reuteri

NOTA: evitare il pipettaggio il più possibile nei passaggi seguenti. Si consiglia l'inclusione di un elettroporazione di controllo, senza aggiunta di plasmide, per garantire che la selezione antibiotica sia adeguata.

1. Prendere un'intera aliquota elettrocompetente di L. reuteri e scongelarla sul ghiaccio.
2. Mescolare delicatamente da 5 μL a 10 μL di plasmide (concentrazione plasmidica finale >6 nM) nell'aliquota scongelata, evitando il più possibile il pipettaggio.
3. Trasferire in una cuvetta di elettroporazione raffreddata con ghiaccio da 1 mm.
4. Elettroporate a 1,25 kV, 400 Ω e 25 μF.
5. Aggiungere 1 mL di brodo MRS a temperatura ambiente (RT) e mescolare capovolgendo la cuvetta una o due volte.
6. Posizionare le cuvette in un incubatore statico a 37 °C per 2,5-3 ore per consentire il recupero.
7. Impiattare l'intera quantità su più piastre di agar MRS con la selezione appropriata.
8. Posizionare i piatti all'interno di un contenitore completamente ermetico con una piccola candela accesa ("candeletta") e una bustina anaerobica generatrice di atmosfera.
9. Crescere a 37 °C per 2-3 giorni o fino alla presenza di colonie visibili.

3. Misurazione della proteina reporter fluorescente resistente agli acidi mCherry2

1. Prelevare eventuali colonie necessarie per la misurazione e inoculare in una micropiastra di stoccaggio a 96 pozzetti con 1,5 ml di brodo MRS sterilizzato con filtro (non sterilizzato) per pozzetto e un antibiotico di selezione appropriato.
2. Incubare aerobicamente per 24 ore durante la notte a 37 °C senza agitare.
   NOTA: Questa micropiastra di conservazione deve essere conservata per l'uso nella sezione 4 (PCR di colonia).
3. L. reuteri precipiterà fuori dai mezzi quando si trova nella fase stazionaria; Risospendere la coltura notturna tramite pipettaggio.
4. Trasferire 200 μL in una piastra piatta, a fondo chiaro, a 96 pozzetti, trasferire la piastra su un lettore di piastre e misurare l'OD e la fluorescenza di mCherry2 (eccitazione [Ex]: 589 nm; emissione [Em]: 610 nm) o di altri reporter pertinenti.

4. Conferma dell'assorbimento del plasmide tramite PCR di colonia

1. Dalla micropiastra di stoccaggio a 96 pozzetti della sezione 3, trasferire 5 μL in una provetta PCR.
   NOTA: Se sono trascorsi >5 minuti, potrebbe essere necessario risospendere il L. reuteri una seconda volta.
2. In una microcentrifuga portatile da banco, ruotare verso il basso fino a quando il pellet può essere visto (circa 2 minuti a 2.000 x g), scartare il surnatante e risospendere il pellet in 20 μL di 20 mM NaOH.
3. Far bollire a 95 °C per 5 minuti, vortice e ripetere l'ebollizione una seconda volta.
4. Raffreddare immediatamente i campioni; cercare di mantenere i campioni sul ghiaccio il più possibile nei seguenti passaggi per ridurre la probabilità di degradazione del modello e inibizione della PCR.
5. Girare in una microcentrifuga portatile da banco a 2.000 x g per 2 minuti fino a quando i detriti cellulari sono pellettati, quindi prendere 1 μL del surnatante e diluire in 99 μL di DDH₂O senza DNasi e RNasi ghiacciato (diluizione 100x).
6. Utilizzare la diluizione 100x come modello di DNA in una reazione PCR standard utilizzando primer plasmidi specifici. Includere un controllo positivo con un plasmide derivato dalla mini-preparazione di E. coli.
7. Restituire i campioni sul ghiaccio e aggiungere un colorante di carico appropriato a una concentrazione 1x.
8. Eseguire in gel di agarosio all'1% in tampone TAE (acido tris-acetato-etilendiamminotetraacetico [EDTA]) a 110 V per 30 minuti. Immagine se necessario.

5. Protocollo Mini-prep per L. reuteri , seguito da PCR per confermare la presenza di plasmidi

NOTA: Protocollo destinato all'uso con il kit mini-prep elencato nella tabella dei materiali.

1. Inoculare L. reuteri in 10 mL di brodo MRS contenente un antibiotico appropriato e incubare aerobicamente per una notte a 37 °C in un incubatore statico.
2. Centrifugare a 5.000 x g per 10 minuti in una centrifuga pre-raffreddata a 4 °C.
3. Lavare il pellet in 2 ml di tampone P1 standard (incluso nel kit) per eliminare l'acidità che potrebbe interferire con i passaggi successivi, centrifugare con la stessa impostazione descritta in precedenza e scartare il surnatante.
4. Risospendere il pellet in 250 μL di tampone P1 modificato contenente 10 mg/mL di lisozima e 100 U/mL di mutanolisina per lisare le cellule batteriche. Incubare per 1-2 h a 37 °C.
5. Aggiungere 250 μL di tampone P2, mescolare capovolgendo da quattro a sei volte e incubare a RT per non più di 5 minuti.
6. Aggiungere 350 μL di tampone N3 (incluso nel kit) e capovolgere immediatamente da quattro a sei volte delicatamente per mescolare.
7. Centrifugare a 10.000 x g per 10 min.
8. Trasferire quanto più surnatante possibile in una colonna di rotazione e centrifugare a 10.000 x g per 60 s. Scartare il flusso attraverso.
9. Lavare la colonna di centrifuga con 500 μL di tampone PB (incluso nel kit) e centrifugare a 10.000 x g per 60 s. Scartare il flusso attraverso.
10. Lavare la colonna di centrifuga con 750 μL di PE tampone (incluso nel kit) e centrifugare a 10.000 x g per 60 s. Scartare il flusso e centrifugare per 60 s per rimuovere eventuali residui di tampone.
11. Posizionare la colonna di rotazione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Applicare 20-30 μL di ddH 2 O privo di DNAsi e RNAsi al filtro della colonna di spin e lasciare agire per_1-2minuti, prima di centrifugare a 10.000 x g per 60 s.
12. Eseguire una reazione PCR standard utilizzando primer plasmidi specifici (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), con eluato che fornisce il DNA modello. Includere un controllo positivo con un plasmide derivato dalla mini-preparazione di E. coli.
    NOTA: Le impostazioni PCR utilizzate in questo studio sono: 98 °C per 5 min, (98 °C per 30 s, 55 °C per 30 s, 72 °C per 45 s) 30 cicli, 72 °C per 2 min, 4 °C hold. I parametri dipendono fortemente dalla polimerasi utilizzata, dalla lunghezza del frammento e dai primer esatti utilizzati da qualsiasi persona che utilizza questo protocollo.

Risultati

Efficienza di trasformazione
L. reuteri non richiede un plasmide dcm-/dam^- non metilato, come osservato per altre Lactobacillaceae^19,20 (vedere Figura 1). L'elettroporazione di L. reuteri DSM20016 con 10 μL del pTRKH3_mCherry2 plasmidico da 8,5 kb (origine della replicazione di pAMβ1 theta) dovrebbe fornire efficienze di trasformazione di circa 80 unità formanti ...

Discussione

Il passo più critico per la trasformazione di L. reuteri DSM20016 è la generazione di condizioni di crescita anaerobica dopo che le trasformazioni sono state placcate; le colonie acquisite in condizioni aerobiche sono solo molto occasionali e generalmente non riescono a crescere quando inoculate nel brodo MRS. Placcare l'intero volume di recupero dovrebbe anche essere praticato per massimizzare la probabilità di crescita della colonia. Anche con queste due fasi critiche, l'efficienza della trasformazione è a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production