Methoden zur Elektroporation und Transformationsbestätigung in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Zusammenfassung

Hier stellen wir Protokolle für die Arbeit mit Limosilactobacillus reuteri DSM20016 vor, die das Wachstum, die Plasmidtransformation, die Kolonie-PCR, die fluoreszierende Reporterproteinmessung und die begrenzte Plasmid-Minivorbereitung detailliert beschreiben, sowie häufige Probleme und Fehlerbehebung. Diese Protokolle ermöglichen die Messung von Reporterproteinen in DSM20016 oder die Bestätigung durch Kolonie-PCR, wenn kein Reporter beteiligt ist.

Zusammenfassung

Lactobacillus waren eine unglaublich große, vielfältige Bakteriengattung mit 261 Arten, von denen einige kommensale Stämme waren, die das Potenzial hatten, als Chassis für synthetische biologische Unternehmungen im Magen-Darm-Trakt verwendet zu werden. Die große phänotypische und genotypische Variation, die innerhalb der Gattung beobachtet wurde, führte zu einer kürzlichen Neuklassifizierung und der Einführung von 23 neuen Gattungen.

Aufgrund der Breite der Variationen innerhalb der alten Gattungen kann es vorkommen, dass Protokolle, die in einem Mitglied nachgewiesen wurden, bei anderen Mitgliedern nicht so funktionieren, wie es angekündigt wurde. Der Mangel an zentralisierten Informationen darüber, wie bestimmte Stämme genau manipuliert werden können, hat zu einer Reihe von Ad-hoc-Ansätzen geführt, die oft von anderen Bakterienfamilien übernommen wurden. Dies kann die Sache für Forscher, die auf diesem Gebiet beginnen, erschweren, da sie möglicherweise nicht wissen, welche Informationen auf die von ihnen gewählte Sorte zutreffen und welche nicht.

In diesem Artikel wollen wir eine Reihe von Protokollen mit nachgewiesenem Erfolg zentralisieren, insbesondere in der Limosilactobacillus reuteri-Stammbezeichnung F275 (andere Sammlungsnummern: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), zusammen mit Ratschlägen zur Fehlerbehebung und häufigen Problemen, auf die man stoßen kann. Diese Protokolle sollten es einem Forscher mit wenig bis gar keiner Erfahrung in der Arbeit mit L. reuteri DSM20016 ermöglichen, ein Plasmid zu transformieren, die Transformation zu bestätigen und die Systemrückkopplung in einem Plattenleser über ein Reporterprotein zu messen.

Einleitung

Die Gattung Lactobacillus wurde historisch als grampositive, stäbchenförmige, nicht sporenbildende Anaerobier oder Mikroaerophile klassifiziert, die Zucker abbauen, um hauptsächlich Milchsäure zu produzieren¹. Diese lockeren Kriterien führten dazu, dass Lactobacillus phänotypisch und genotypisch eine äußerst vielfältige Gattung ist. Diese breite Kategorisierung führte dazu, dass die Gattung neu klassifiziert wurde und im Jahr 2020 23 neue Gattungen eingeführt wurden².

Die alte, breitere Gattung umfasste wichtige kommensale und probiotische Arten, die allgemein als sicher für den Verzehr angesehen werden (GRAS)³. Die Familie der Lactobacillaceae wird in der Öffentlichkeit aufgrund vieler berichteter gesundheitlicher Vorteile, die durch den Verzehr^{verschiedener Stämme erzielt} werden, als "gute Bakterien" wahrgenommen 4,5,6,7. Die Leichtigkeit, mit der sie sich im Magen-Darm-Trakt zurechtfinden 8^{, und ihre} öffentliche Akzeptanz machen Lactobacillaceae-Stämme zu starken Kandidaten als Chassis-Organismen für einnehmbare medizinische, therapeutische oder diagnostische Anwendungen.

Das breite Spektrum an Merkmalen, die innerhalb der Familie der Lactobacillaceae vorhanden sind, hat zu einer Situation geführt, in der es de facto keinen Modellorganismusstamm gibt; Forschungsgruppen tendieren dazu, Arten mit den Eigenschaften auszuwählen, die für ihre jeweiligen Ziele am relevantesten sind. (Zum Beispiel könnten Milchfermentationslabore L. lactis auswählen; Studien zur pflanzlichen Fermentation könnten L. plantarum auswählen; die Forschung an Probiotika könnte sich auf L. acidophilus konzentrieren; und so weiter.)

Dieselbe breite Palette von Merkmalen über alle Arten hinweg hat zu einer Anhäufung von Protokollen und Verfahren geführt, die für eine Untergruppe der Lactobacillaceae-Familie gut funktionieren können, aber bei anderen optimiert werden müssen, um effizient zu funktionieren (oder vielleicht überhaupt zu funktionieren)⁹. Dieser Optimierungsbedarf zwischen Familienmitgliedern und sogar innerhalb von Mitgliedern derselben Art kann die Bemühungen unbekannter Forscher vereiteln. Protokolle, die in den Methodenabschnitten von Artikeln veröffentlicht werden, können auch ihre eigenen Modifikationen¹⁰ enthalten, was zu fragmentierten, dezentralen Protokollsammlungen führt.

L. reuteri gilt als weit verbreiteter Wirbeltier-Kommensal, der durchweg im Magen-Darm-Trakt von Säugetieren, Vögeln¹¹ und Fischen¹² vorkommt. L. reuteri-Unterstämme sind oft genetisch spezialisiert, indem sie sich an Schleimadhäsionsproteine anpassen, um bestimmte einheimische Wirte dauerhafter zu besiedeln 8,11,13. Limosilactobacillus-Arten aus dem Magen-Darm-Trakt können in Wirten außerhalb ihres heimischen Wirts isoliert werden, tendieren aber eher zu einer vorübergehenden Natur⁸.

Aufgrund der Spezialisierung von Mensch und Wirt positioniert sich L. reuteri DSM20016 sehr gut als Chassis für diagnostische oder therapeutische Anwendungen an jedem Punkt des menschlichen Magen-Darm-Trakts, und der Stamm DSM20016 könnte im Vergleich zu transitorischen Stämmen ein länger anhaltendes Wirkungsfenster für Interventionen bieten.

In diesem Artikel skizzieren wir eine Reihe von Protokollen mit nachgewiesener Wirksamkeit bei Limosilactobacillus reuteri (Stammbezeichnung: F275; andere Sammlungsnummern: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), zusammen mit zentralisierten Informationen über den Stamm aus anderen Quellen, um molekular- und systembiologische Anwendungen zu unterstützen. Die hier beschriebenen Verfahren sollten es einem Forscher ohne vorherige Erfahrung ermöglichen, L. reuteri zu kultivieren, elektrokompetente Bestände zu schaffen, transformierte Kolonien auszuwählen, die Transformation durch die Koloniepolymerase-Kettenreaktion (PCR) zu bestätigen und die geplante Systemantwort über fluoreszierende Reporterproteine zu messen.

Wir stellen fest, dass verwandte Protokolle die CRISPR-Cas9-unterstützte ssDNA-Genom-Rekombinierung in L. reuteri (Stamm: ATCC-PTA-6475)¹⁴ und die CRSIPR-Cas9-Nickase-unterstützte Genomeditierung in mehreren nicht-L. reuteri, Lactobacillaceae-Familienfärbungen ^15,16; Diese befassen sich jedoch nicht mit dem Stamm L. reuteri DSM20016, auf den wir uns hier konzentrieren.

Protokoll

1. Herstellung von L. reuteri DSM20016 elektrokompetente Zellen

HINWEIS: Dies basiert auf einem Protokoll von Berthier et ^al.17, wobei die Zentrifugationsgeschwindigkeiten von Rattanachaikunsopon et al.¹⁸. Der Teufel

1. In einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen L. reuteri aus dem Glycerinvorrat in 6 ml deMan Rogosa Sharpe (MRS)-Brühe beimpfen. Aerob über Nacht bei 37 °C in einem statischen Inkubator inkubieren.
2. Am nächsten Morgen werden 4 ml der Nachtkultur in 200 ml MRS-Brühe (1:50 Verdünnung) geimpft.
3. In einem statischen Inkubator bei 37 °C aerob wachsen lassen, bis der optische Dichtewert von 600 nm (OD600) 0,5-0,85 erreicht; Dies sollte etwa 2-3 Stunden dauern.
4. Sobald ein adäquater OD600-Wert erreicht ist, wird das Medium in 50-ml-Zentrifugenröhrchen umgefüllt und unter Auswuchten der Röhrchen auf Eis gelegt.
5. 5 min bei 5.000 x g in einer vorgekühlten Zentrifuge bei 4 °C zentrifugieren.
6. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie jedes Pellet in 50 ml vorgekühltem (0 °C bis 4 °C) ddH₂O und zentrifugieren Sie erneut mit den gleichen Einstellungen wie im vorherigen Schritt. Bewahren Sie die Zellen so weit wie möglich auf Eis auf.
7. Wiederholen Sie Schritt 1.6.
8. Resuspendieren Sie jedes Pellet in 25 ml_ddH2O: 0,5 M Saccharose, 10 % Glycerin. Zentrifugieren bei 5.000 x g bei 4 °C für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie die Zellen wieder auf Eis.
9. Resuspendieren Sie alle Pellets in denselben 2 ml_ddH2O: 0,5 M Saccharose, 10% Glycerin.
10. Aliquot in Portionen von 50 μl bis 100 μl in vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen; Für die spätere Verwendung bei -80 °C lagern.

2. Elektroporation von L. reuteri

HINWEIS: Vermeiden Sie in den folgenden Schritten das Pipettieren so weit wie möglich. Der Einbau einer Kontrollelektroporation ohne Zusatz von Plasmid wird empfohlen, um sicherzustellen, dass die Antibiotikaauswahl angemessen ist.

1. Nehmen Sie ein ganzes elektrokompetentes L. reuteri aliquot und tauen Sie es auf Eis auf.
2. Mischen Sie vorsichtig 5 μl bis 10 μl Plasmid (Endplasmidkonzentration >6 nM) in das aufgetaute Aliquot und vermeiden Sie das Pipettieren so weit wie möglich.
3. In eine eisgekühlte Elektroporationsküvette mit 1 mm Spalt überführen.
4. Elektroporat bei 1,25 kV, 400 Ω und 25 μF.
5. Fügen Sie 1 ml MRS-Brühe bei Raumtemperatur (RT) hinzu und mischen Sie, indem Sie die Küvette ein- oder zweimal umdrehen.
6. Legen Sie die Küvetten für 2,5-3 h in einen statischen Inkubator bei 37 °C, damit sie sich erholen können.
7. Verteilen Sie die gesamte Menge auf mehrere MRS-Agarplatten mit entsprechender Auswahl.
8. Stellen Sie die Teller in einen vollständig luftdichten Behälter mit einer kleinen brennenden Kerze ("Teelicht") und einem anaeroben Atmosphärenbeutel.
9. Wachsen Sie bei 37 °C für 2-3 Tage oder bis sichtbare Kolonien vorhanden sind.

3. Messung des säureresistenten fluoreszierenden Reporterproteins mCherry2

1. Wählen Sie alle für die Messung erforderlichen Kolonien aus und beimpfen Sie sie in eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit 1,5 ml filtersterilisierter (nicht autoklavierter) MRS-Brühe pro Vertiefung und einem geeigneten Auswahlantibiotikum.
2. Aerob 24 h über Nacht bei 37 °C ohne Schütteln inkubieren.
   HINWEIS: Diese Mikrotiterplatte sollte für die Verwendung in Abschnitt 4 (Kolonie-PCR) aufbewahrt werden.
3. L. reuteri fällt in der stationären Phase aus dem Medium aus; Resuspendieren Sie die Kultur über Nacht durch Pipettieren.
4. Übertragen Sie 200 μl in eine flache 96-Well-Platte mit klarem Boden, übertragen Sie die Platte auf ein Plattenlesegerät und messen Sie den Außendurchmesser und die Fluoreszenz von mCherry2 (Anregung [Ex]: 589 nm; Emission [Em]: 610 nm) oder anderen relevanten Reportern.

4. Bestätigung der Plasmidaufnahme mittels Kolonie-PCR

1. Von der 96-Well-Speichermikrotiterplatte aus Abschnitt 3 werden 5 μl in ein PCR-Röhrchen überführt.
   HINWEIS: Wenn >5 Minuten vergangen sind, kann es notwendig sein, den L. reuteri ein zweites Mal zu resuspendieren.
2. In einer tragbaren Tischmikrozentrifuge nach unten schleudern, bis das Pellet sichtbar ist (ca. 2 min bei 2.000 x g), den Überstand verwerfen und das Pellet in 20 μl 20 mM NaOH resuspendieren.
3. Bei 95 °C 5 min kochen, vortexen und das Kochen ein zweites Mal wiederholen.
4. Kühlen Sie die Proben sofort; Versuchen Sie, die Proben in den folgenden Schritten so weit wie möglich auf Eis zu halten, um die Wahrscheinlichkeit einer Template-Degradation und PCR-Inhibition zu verringern.
5. In einer tragbaren Tisch-Mikrozentrifuge bei 2.000 x g 2 min lang herunterschleudern, bis die Zelltrümmer pelletiert sind, dann 1 μl des Überstands nehmen und zu 99 μl eiskaltem DNase- und RNase-freiem_ddH2O(100-fache Verdünnung) verdünnen.
6. Verwenden Sie die 100-fache Verdünnung als Template-DNA in einer Standard-PCR-Reaktion unter Verwendung plasmidspezifischer Primer. Fügen Sie eine Positivkontrolle mit einem Plasmid hinzu, das aus dem E. coli-Minipräparat gewonnen wurde.
7. Geben Sie die Proben auf Eis zurück und fügen Sie einen geeigneten Beladungsfarbstoff in einer Konzentration von 1x hinzu.
8. 1%iges Agarosegel in TAE-Puffer (Trisacetat-Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]) bei 110 V für 30 min laufen lassen. Bild bei Bedarf.

5. Mini-Prep-Protokoll für L. reuteri , gefolgt von PCR zur Bestätigung des Plasmidvorhandenseins

HINWEIS: Das Protokoll ist für die Verwendung mit dem Mini-Vorbereitungskit vorgesehen, das in der Materialtabelle aufgeführt ist.

1. L. reuteri wird in 10 ml MRS-Brühe mit einem geeigneten Antibiotikum geimpft und über Nacht bei 37 °C in einem statischen Inkubator aerob inkubiert.
2. Bei 5.000 x g für 10 min in einer vorgekühlten 4 °C-Zentrifuge zentrifugieren.
3. Waschen Sie das Pellet in 2 ml Standard-P1-Puffer (im Lieferumfang enthalten), um Säure zu vermeiden, die spätere Schritte beeinträchtigen könnte, zentrifugieren Sie mit der gleichen Einstellung wie zuvor beschrieben und entsorgen Sie den Überstand.
4. Resuspendieren Sie das Pellet in 250 μl modifiziertem P1-Puffer, der 10 mg/ml Lysozym und 100 U/ml Mutanolysin enthält, um die Bakterienzellen zu lysieren. 1-2 h bei 37 °C inkubieren.
5. Fügen Sie 250 μl Puffer P2 hinzu, mischen Sie durch vier- bis sechsmaliges Invertieren und inkubieren Sie bei RT nicht länger als 5 Minuten.
6. Fügen Sie 350 μl Puffer N3 (im Lieferumfang enthalten) hinzu und drehen Sie ihn sofort vier- bis sechsmal vorsichtig um, um ihn zu mischen.
7. Zentrifugieren bei 10.000 x g für 10 min.
8. Übertragen Sie so viel Überstand wie möglich in eine Schleudersäule und zentrifugieren Sie sie 60 s lang bei 10.000 x g . Verwerfen Sie den Durchfluss.
9. Waschen Sie die Schleudersäule mit 500 μl Puffer PB (im Lieferumfang enthalten) und zentrifugieren Sie sie 60 s lang bei 10.000 x g . Verwerfen Sie den Durchfluss.
10. Waschen Sie die Schleudersäule mit 750 μl PE-Puffer (im Lieferumfang enthalten) und zentrifugieren Sie sie 60 s lang bei 10.000 x g . Verwerfen Sie den Durchfluss und zentrifugieren Sie ihn 60 Sekunden lang, um den verbleibenden Puffer zu entfernen.
11. Setzen Sie die Spin-Säule in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein. 20-30 μL DNAse- und RNAse-freies ddH 2 O auf den Filter der Spin-Säule geben und_1-2min ruhen lassen, dann 60 s bei 10.000 x g zentrifugieren.
12. Führen Sie eine Standard-PCR-Reaktion mit plasmidspezifischen Primern (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA) durch, wobei das Eluat die Template-DNA liefert. Fügen Sie eine Positivkontrolle mit einem Plasmid hinzu, das aus dem E. coli-Minipräparat gewonnen wurde.
    HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten PCR-Einstellungen sind: 98 °C für 5 min, (98 °C für 30 s, 55 °C für 30 s, 72 °C für 45 s) 30 Zyklen, 72 °C für 2 min, 4 °C halten. Die Parameter hängen stark von der verwendeten Polymerase, der Fragmentlänge und den genauen Primern ab, die von jeder Person verwendet werden, die dieses Protokoll verwendet.

Ergebnisse

Effizienz der Transformation
L. reuteri benötigt kein dcm-/dam-nicht-methyliertes Plasmid, wie es bei anderen Lactobacillaceae^{beobachtet wurde 19,20} (siehe Abbildung 1). Die Elektroporation von L. reuteri DSM20016 mit 10 μL des 8,5 kb Plasmids pTRKH3_mCherry2 (pAMβ1 Theta-Ursprung der Replikation) sollte Transformationseffizienzen von etwa 80 koloniebildenden Ein...

Diskussion

Der kritischste Schritt für die Transformation von L. reuteri DSM20016 ist die Erzeugung von anaeroben Wachstumsbedingungen nach der Transformation; Kolonien, die unter aeroben Bedingungen gewonnen werden, sind nur sehr selten und wachsen im Allgemeinen nicht, wenn sie in MRS-Brühe geimpft werden. Die Beschichtung des gesamten Erholungsvolumens sollte ebenfalls geübt werden, um die Wahrscheinlichkeit des Koloniewachstums zu maximieren. Selbst mit diesen beiden kritischen Schritten ist die Transformationseffiz...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production