Methoden zur Elektroporation und Transformationsbestätigung in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Zusammenfassung

Hier stellen wir Protokolle für die Arbeit mit Limosilactobacillus reuteri DSM20016 vor, die das Wachstum, die Plasmidtransformation, die Kolonie-PCR, die fluoreszierende Reporterproteinmessung und die begrenzte Plasmid-Minivorbereitung detailliert beschreiben, sowie häufige Probleme und Fehlerbehebung. Diese Protokolle ermöglichen die Messung von Reporterproteinen in DSM20016 oder die Bestätigung durch Kolonie-PCR, wenn kein Reporter beteiligt ist.

Zusammenfassung

Lactobacillus waren eine unglaublich große, vielfältige Bakteriengattung mit 261 Arten, von denen einige kommensale Stämme waren, die das Potenzial hatten, als Chassis für synthetische biologische Unternehmungen im Magen-Darm-Trakt verwendet zu werden. Die große phänotypische und genotypische Variation, die innerhalb der Gattung beobachtet wurde, führte zu einer kürzlichen Neuklassifizierung und der Einführung von 23 neuen Gattungen.

Aufgrund der Breite der Variationen innerhalb der alten Gattungen kann es vorkommen, dass Protokolle, die in einem Mitglied nachgewiesen wurden, bei anderen Mitgliedern nicht so funktionieren, wie es angekündigt wurde. Der Mangel an zentralisierten Informationen darüber, wie bestimmte Stämme genau manipuliert werden können, hat zu einer Reihe von Ad-hoc-Ansätzen geführt, die oft von anderen Bakterienfamilien übernommen wurden. Dies kann die Sache für Forscher, die auf diesem Gebiet beginnen, erschweren, da sie möglicherweise nicht wissen, welche Informationen auf die von ihnen gewählte Sorte zutreffen und welche nicht.

In diesem Artikel wollen wir eine Reihe von Protokollen mit nachgewiesenem Erfolg zentralisieren, insbesondere in der Limosilactobacillus reuteri-Stammbezeichnung F275 (andere Sammlungsnummern: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), zusammen mit Ratschlägen zur Fehlerbehebung und häufigen Problemen, auf die man stoßen kann. Diese Protokolle sollten es einem Forscher mit wenig bis gar keiner Erfahrung in der Arbeit mit L. reuteri DSM20016 ermöglichen, ein Plasmid zu transformieren, die Transformation zu bestätigen und die Systemrückkopplung in einem Plattenleser über ein Reporterprotein zu messen.

Einleitung

Die Gattung Lactobacillus wurde historisch als grampositive, stäbchenförmige, nicht sporenbildende Anaerobier oder Mikroaerophile klassifiziert, die Zucker abbauen, um hauptsächlich Milchsäure zu produzieren¹. Diese lockeren Kriterien führten dazu, dass Lactobacillus phänotypisch und genotypisch eine äußerst vielfältige Gattung ist. Diese breite Kategorisierung führte dazu, dass die Gattung neu klassifiziert wurde und im Jahr 2020 23 neue Gattungen eingeführt wurden².

Die alte, breitere Gattung umfasste wichtige kommensale und probiotische Arten, die allgemein als sicher für ....

Protokoll

1. Herstellung von L. reuteri DSM20016 elektrokompetente Zellen

HINWEIS: Dies basiert auf einem Protokoll von Berthier et ^al.17, wobei die Zentrifugationsgeschwindigkeiten von Rattanachaikunsopon et al.¹⁸. Der Teufel

1. In einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen L. reuteri aus dem Glycerinvorrat in 6 ml deMan Rogosa Sharpe (MRS)-Brühe beimpfen. Aerob über Nacht bei 37 °C in einem statischen Inkubator inkubieren.
2. Am nächsten Morgen werden 4 ml der Nachtkultur in 200 ml MRS-Brühe (1:50 Verdünnung) geimpft.
3. In einem statischen Inkubat....

Diskussion

Der kritischste Schritt für die Transformation von L. reuteri DSM20016 ist die Erzeugung von anaeroben Wachstumsbedingungen nach der Transformation; Kolonien, die unter aeroben Bedingungen gewonnen werden, sind nur sehr selten und wachsen im Allgemeinen nicht, wenn sie in MRS-Brühe geimpft werden. Die Beschichtung des gesamten Erholungsvolumens sollte ebenfalls geübt werden, um die Wahrscheinlichkeit des Koloniewachstums zu maximieren. Selbst mit diesen beiden kritischen Schritten ist die Transformationseffiz.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production