リ モシラクトバチルス・ロイテリ におけるエレクトロポレーションと形質転換確認の方法 DSM20016

要約

ここでは、 Limosilactobacillus reuteri DSM20016を使用するためのプロトコル、増殖、プラスミド形質転換、コロニーPCR、蛍光レポータータンパク質測定、および限定的なプラスミドミニプレップ、および一般的な問題とトラブルシューティングについて詳しく説明します。これらのプロトコルにより、DSM20016中のレポータータンパク質の測定、またはレポーターが関与しない場合はコロニーPCR による 確認が可能になります。

要約

Lactobacillus は、261種からなる信じられないほど大きく多様な細菌属であり、そのうちのいくつかは、胃腸管内の合成生物学的努力のシャーシとして使用する可能性のある共生株でした。属内で観察された幅広い表現型と遺伝子型の多様性は、最近の再分類と23の新規属の導入につながりました。

古い属内のバリエーションの幅が広いため、あるメンバーで示されたプロトコルは、他のメンバーと宣伝されているように機能しない場合があります。特定の菌株を正確に操作する方法に関する一元化された情報の欠如は、しばしば他の細菌ファミリーから適応されたさまざまな アドホック アプローチにつながりました。これは、どの情報が選択した株に適用されるか、または適用されないかを知らない可能性のある、この分野に参入する研究者にとって問題を複雑にする可能性があります。

この論文では、特に Limosilactobacillus reuteri 株指定F275(その他のコレクション番号:DSM20016、ATCC23272、CIP109823)で、成功が実証された一連のプロトコルを、トラブルシューティングのアドバイスと発生する可能性のある一般的な問題とともに一元化することを目指しています。これらのプロトコルにより、 L. reuteri DSM20016を使用した経験がほとんどまたはまったくない研究者でも、プラスミドの形質転換、形質転換の確認、およびレポータータンパク質 を介した プレートリーダーでのシステムフィードバックの測定が可能になります。

概要

ラクトバチルス属は歴史的に、グラム陽性、棒状、非胞子形成、通性嫌気性菌または糖を分解して主に乳酸を生成する微好気性菌のいずれかに分類されていました¹。これらの緩い基準により、ラクトバチルスは表現型的にも遺伝子型的にも非常に多様な属になりました。この大まかな分類により、属は再分類され、2020年に23の新規属が導入され^{ました2。}

古くてより広い属には、一般的に消費に安全であると考えられている主要な共生種とプロバイオティクス種(GRAS)が含まれていました³。乳酸菌科は、さまざまな菌株の消費によってもたらされる多くの報告された健康上の利点により、「善玉菌」であるという一般の認識を維持しています4,5,6,7。彼らが胃腸管^をナビゲートできることの容易さ8と彼らの一般の受け入れは、Lactobacillaceae株を摂取可能な薬用、治療、または診断アプリ....

プロトコル

1. L. ロイテリDSM20016 エレクトロコンピテントセルの作製

注:これはBerthierらによるプロトコルに基づいています¹⁷、遠心分離速度はRattanachaikunsoponらによって知らされています。¹⁸.

1. 50 mL 遠心チューブで、グリセロールストックから L. ロイテリ を 6 mL のデマンロゴサシャープ(MRS)ブロスに接種します。静的インキュベーター内で37°Cで一晩好気的にインキュベートします。
2. 翌朝、一晩培養した4 mLをMRSブロス200 mL(1:50希釈)に接種します。
3. 600 nmの光学密度値(OD600)が0.5〜0.85に達するまで、静的な37°Cインキュベーターで好気的に成長させます。これには約2〜3時間かかります。
4. 適切なOD600値に達したらすぐに、培地を50 mLの遠沈管にデカントし、管のバランスを取りながら氷上に置きます。
5. 予冷した4°Cの遠心分離機で5,000 x g で5分間遠心分離します。
6. 上清を捨て、各ペレットを予め冷却した(0°C〜4°C)_ddH2Oの50mLに再懸濁し、前....

ディスカッション

L. reuteri DSM20016の形質転換のための最も重要なステップは、形質転換がプレーティングされた後の嫌気性増殖条件の生成である。好気性条件で得られたコロニーはごくまれにしかなく、MRSブロスに接種すると一般に成長しません。コロニーの成長の可能性を最大化するために、回収量全体をプレーティングすることも実施する必要があります。これらの2つの重要なステップがあっても?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production