تصنيع وتغليف كروي للورم في الهلاميات المائية المصنوعة من البولي إيثيلين جلايكول لدراسة تفاعلات المصفوفة الكروية

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا يتيح التصنيع السريع والقوي والرخيص للكرويات السرطانية متبوعا بتغليف الهيدروجيل. إنه قابل للتطبيق على نطاق واسع لأنه لا يتطلب معدات متخصصة. سيكون مفيدا بشكل خاص لاستكشاف تفاعلات المصفوفة الكروية وبناء فسيولوجيا الأنسجة المختبرية أو نماذج علم الأمراض.

Abstract

يعد التغليف ثلاثي الأبعاد (3D) للكرويات أمرا بالغ الأهمية لتكرار البيئة المكروية للورم بشكل كاف لتحقيق النمو الأمثل للخلايا. هنا ، قمنا بتصميم نموذج الورم الأرومي الدبقي 3D في المختبر لتغليف كروي لتقليد البيئة المكروية خارج الخلية للورم. أولا ، قمنا بتشكيل قوالب microwell هرمية مربعة باستخدام polydimethylsiloxane. ثم تم استخدام قوالب microwell هذه لتصنيع كرويات الورم بأحجام يتم التحكم فيها بإحكام من 50-500 ميكرومتر. بمجرد تكوين الأجسام الكروية ، تم حصادها وتغليفها في الهلاميات المائية القائمة على البولي إيثيلين جلايكول (PEG). الهلاميات المائية PEG هي منصة متعددة الاستخدامات لتغليف كروي ، حيث يمكن ضبط خصائص الهيدروجيل مثل الصلابة والتحلل والالتصاق الخلايا بشكل مستقل. هنا ، استخدمنا هيدروجيل ناعم تمثيلي (~ 8 كيلو باسكال) لتغليف كرويات الورم الأرومي الدبقي. أخيرا ، تم تطوير طريقة لتلطيخ وصور كرويات للحصول على صور عالية الجودة عبر الفحص المجهري متحد البؤر. نظرا للنواة الكروية الكثيفة والأطراف المتناثرة نسبيا ، قد يكون التصوير صعبا ، ولكن استخدام محلول المقاصة والتقسيم البصري متحد البؤر يساعد في تخفيف صعوبات التصوير هذه. باختصار ، نعرض طريقة لتصنيع كرويات موحدة ، وتغليفها في الهلاميات المائية PEG وإجراء الفحص المجهري متحد البؤر على الكرات المغلفة لدراسة نمو الكروية وتفاعلات مصفوفة الخلية المختلفة.

Introduction

ظهرت كرويات الورم على أنها مفيدة في الأدوات المختبرية في دراسة مسببات السرطان وعلم الأمراض والاستجابة للأدوية¹. تقليديا ، تم استزراع الكائنات الكروية في ظروف مثل ألواح الالتصاق المنخفضة أو المفاعلات الحيوية ، حيث يفضل التصاق الخلايا الخلوية على التصاق سطح الخلية². ومع ذلك ، فمن المسلم به الآن أنه لتلخيص البيئة المكروية للورم بشكل أكثر إخلاصا ، يجب أن تلتقط النماذج الكروية في المختبر تفاعلات كل من الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا. وقد دفع هذا مجموعات متعددة إلى تصميم سقالات ، مثل الهلاميات المائية ، حيث يمكن تغليف الأجسام الكروية ^3,4. تتيح هذه الن....

Protocol

1. إعداد الحلول

1. تحضير محلول السلائف بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS)
   1. قم بإعداد محلول السلائف PDMS السلبي (يستخدم أيضا لمحلول سلائف الغراء). اغرف المطاط الصناعي في وعاء الوزن باستخدام ملعقة وقم بوزنه. أضف عامل المعالجة إلى قاعدة المطاط الصناعي بنسبة 1:10. امزج PDMS وعامل المعالجة برفق ودقة باستخدام الملعقة الموجودة في قارب الوزن البلاستيكي.
      ملاحظة: يتم سكب محلول سلائف PDMS هذا في لوحة microwell الهرمية المربعة المكونة من 6 آبار لتشكيل القالب السالب. هذا هو نفس الحل المستخدم في محلول سلائف الغراء.
   2. قم بإعداد حل السلائف PDMS الإيجابي. اغرف قاعدة المطاط الصناعي في وعاء الوزن باستخدام ملعقة وقم بوزنها. أضف عامل المعالجة إلى قاعدة ا....

النتائج

يتم البحث بشكل متزايد عن منصات فحص الأدوية القائمة على الكروية لدراسة تأثيرات العلاج الكيميائي بسبب التركيز على تعديل البيئة المكروية للورم عند تغليف كروي في المواد الحيوية التي تكرر الأنسجة الأصلية. هنا قمنا بتطوير طريقة لإعداد كروية الورم متعدد الخلايا والتغليف اللاحق والتصوير في هيد.......

Discussion

يتم تطوير نماذج كروية للورم متعدد الخلايا القائمة على الهيدروجيل بشكل متزايد لتعزيز الاكتشافات العلاجية للسرطان^11،13،29. إنها مفيدة لأنها تحاكي المعلمات الرئيسية للبيئة المكروية للورم بطريقة خاضعة للرقابة ، وعلى الرغم من تعقيدها ، فهي أب.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Fisher Scientific	LC22210-4
15 mL Conicals	FALCON	352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates	Fisher Scientific	07-200-602
35 mm Petri Dish	Amazon	706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
6-well AggreWell 400	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	34421	Square pyramidal microwells
anti-adherence rinsing solution	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free	Corning	356234	Basement membrane matrix
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Thermo Scientific	62247
Detergent - Triton-X	Sigma Aldrich	T8787	Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Hemacytometer	Bright-Line	383684
Hydrophobic solution - Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)	Fisher Scientific	D1125
Leica Confocal SP8	Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 mL: 02681258
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
Parafilm	PARAFILM	PM992
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)	Amazon	mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)	Laysan Bio	SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004	Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.	Fisher Scientific	AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)	Sigma Aldrich	90279
Trypsin 0.25% (1x)	Sigma Aldrich	SH30042.01
U-87 MG human glioblastoma cells	American Type Culture Collection	HTB-14