스페로이드-매트릭스 상호 작용 연구를 위한 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔의 종양 스페로이드 제조 및 캡슐화

요약

여기에서는 종양 스페로이드를 빠르고 강력하며 저렴하게 제조한 후 하이드로겔 캡슐화를 수행할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 특수 장비가 필요하지 않기 때문에 널리 적용 가능합니다. 스페로이드 매트릭스 상호 작용을 탐색하고 체외 조직 생리학 또는 병리학 모델을 구축하는 데 특히 유용할 것입니다.

초록

스페로이드의 3차원(3D) 캡슐화는 최적의 세포 성장을 위해 종양 미세환경을 적절하게 복제하는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 종양 세포외 미세환경을 모방하기 위해 스페로이드 캡슐화를 위한 시험관 내 3D 교모세포종 모델을 설계했습니다. 먼저, 폴리디메틸실록산을 사용하여 정사각형 피라미드형 마이크로웰 몰드를 형성했습니다. 그런 다음 이 마이크로웰 몰드를 사용하여 50-500μm의 엄격하게 제어된 크기의 종양 스페로이드를 제작했습니다. 스페로이드가 형성되면 수거하여 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기반 하이드로겔에 캡슐화했습니다. PEG 하이드로겔은 스페로이드 캡슐화를 위한 다목적 플랫폼으로, 강성, 분해성 및 세포 접착성과 같은 하이드로겔 특성을 독립적으로 조정할 수 있습니다. 여기서는 대표적인 연화(~8kPa) 하이드로겔을 사용하여 교모세포종 스페로이드를 캡슐화했습니다. 마지막으로, 스페로이드를 염색하고 이미지화하는 방법이 개발되어 컨포칼 현미경을 통해 고품질 이미지를 얻을 수 있습니다. 조밀한 스페로이드 코어와 상대적으로 희박한 주변부로 인해 이미징이 어려울 수 있지만 투명화 용액과 공초점 광학 절편을 사용하면 이러한 이미징 어려움을 완화하는 데 도움이 됩니다. 요약하면, 균일한 스페로이드를 제조하고, PEG 하이드로겔에 캡슐화하고, 캡슐화된 스페로이드에 대해 공초점 현미경을 수행하여 스페로이드 성장 및 다양한 세포-기질 상호 작용을 연구하는 방법을 보여줍니다.

서문

종양 스페로이드는 암 병인학, 병리학 및 약물 반응성을 연구하는 데 유용한 시험관 내 도구로 부상했습니다¹. 전통적으로 스페로이드는 저접착 플레이트 또는 바이오리액터와 같은 조건에서 배양되어 왔으며, 세포 표면 접착보다 세포간 접착이 선호됩니다². 그러나 이제 종양 미세환경을 보다 충실하게 재현하기 위해 시험관 내 스페로이드 모델은 세포-세포 및 세포-기질 상호 작용을 모두 캡처해야 한다는 것이 인식되었습니다. 이로 인해 여러 그룹이 스페로이드를 캡슐화할 수 있는 하이드로겔과 같은 스캐폴드를 설계하게 되었습니다 ^3,4. 이러한 하이드로겔 기반 스페로이드 모델은 생존율, 증식, 줄기성 또는 치료 반응성과 같은 다양한 세포 거동에 대한 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용을 규명할 수 있습니다³.

여기서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 하이드로겔에서 교모세포종 스페로이드를 캡슐화하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 하이드로겔의 교모세포종 세포 스페로이드 캡슐화에 대한 여러 문헌 보고가 있습....

프로토콜

1. 솔루션 준비

1. 폴리디메틸실록산(PDMS) 전구체 용액의 제조
   1. 네거티브 PDMS 전구체 용액(접착제 전구체 용액에도 사용됨)을 준비합니다. 주걱을 사용하여 엘라스토머를 계량 보트에 퍼서 무게를 잰다. 경화제를 엘라스토머 베이스에 1:10 비율로 추가합니다. 플라스틱 계량 보트의 주걱을 사용하여 PDMS와 경화제를 부드럽고 완전히 혼합합니다.
      알림: 이 PDMS 전구체 용액을 6웰 정사각형 피라미드 마이크로웰 플레이트에 부어 네거티브 몰드를 형성합니다. 이것은 접착제 전구체 용액에 사용되는 것과 동일한 용액입니다.
   2. 포지티브 PDMS 전구체 용액을 준비합니다. 주걱을 사용하여 엘라스토머 베이스를 계량 보트에 퍼서 무게를 잰다. 경화제를 엘라스토머 베이스에 1:9 비율로 추가합니다. 플라스틱 계량 보트의 주걱을 사용하여 PDMS와 경화제를 부드럽고 완전히 혼합합니다.
      참고: 이 PDMS 전구체 용액은 나중에 음극 금형에 부어 양극 금형을 형성합니다.
2. pH 8의 0.3M 트리에탄올아민(TEA) 완충액 제조
   1. 피펫 보조제를 사용하여 1mL의 TEA와 9mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 50mL 원뿔형에 피펫팅하여 0.75M TEA 용액을 만듭니다. 1....

토론

하이드로겔 기반 다세포 종양 스페로이드 모델은 암 치료 발견을 발전시키기 위해 점점 더 많이 개발되고 있습니다 11,13,29. 이 모델은 통제된 방식으로 종양 미세환경의 주요 파라미터를 모방하고, 복잡성에도 불구하고 in vivo 모델보다 사용이 간단하고 저렴하며, 많은 모델이 고처리량 스크리닝 기술과 호환되기 때문에 유용?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Fisher Scientific	LC22210-4
15 mL Conicals	FALCON	352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates	Fisher Scientific	07-200-602
35 mm Petri Dish	Amazon	706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
6-well AggreWell 400	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	34421	Square pyramidal microwells
anti-adherence rinsing solution	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free	Corning	356234	Basement membrane matrix
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Thermo Scientific	62247
Detergent - Triton-X	Sigma Aldrich	T8787	Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Hemacytometer	Bright-Line	383684
Hydrophobic solution - Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)	Fisher Scientific	D1125
Leica Confocal SP8	Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 mL: 02681258
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
Parafilm	PARAFILM	PM992
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)	Amazon	mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)	Laysan Bio	SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004	Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.	Fisher Scientific	AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)	Sigma Aldrich	90279
Trypsin 0.25% (1x)	Sigma Aldrich	SH30042.01
U-87 MG human glioblastoma cells	American Type Culture Collection	HTB-14