Изготовление и инкапсуляция сфероидов опухолей в гидрогелях полиэтиленгликоля для изучения сфероидно-матричных взаимодействий

Резюме

Здесь мы представляем протокол, который позволяет быстро, надежно и дешево изготавливать опухолевые сфероиды с последующей гидрогелевой инкапсуляцией. Он широко применим, так как не требует специализированного оборудования. Это было бы особенно полезно для изучения сфероидно-матричных взаимодействий и построения in vitro моделей физиологии тканей или патологии.

Аннотация

Трехмерная (3D) инкапсуляция сфероидов имеет решающее значение для адекватной репликации микроокружения опухоли для оптимального роста клеток. Здесь мы разработали 3D-модель глиобластомы in vitro для инкапсуляции сфероида, чтобы имитировать внеклеточное микроокружение опухоли. Сначала мы сформировали квадратные пирамидальные формы для микролунок с использованием полидиметилсилоксана. Эти формы с микролунками затем использовались для изготовления опухолевых сфероидов с жестко контролируемыми размерами от 50 до 500 мкм. После того, как сфероиды были сформированы, их собирали и инкапсулировали в гидрогели на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ). Гидрогели ПЭГ являются универсальной платформой для инкапсуляции сфероидов, поскольку такие свойства гидрогеля, как жесткость, разлагаемость и адгезивность ячеек, можно настраивать независимо друг от друга. Здесь мы использовали репрезентативный мягкий (~8 кПа) гидрогель для инкапсуляции сфероидов глиобластомы. Наконец, был разработан метод окрашивания и изображения сфероидов для получения высококачественных изображений с помощью конфокальной микроскопии. Из-за плотного сфероидального ядра и относительно редкой периферии визуализация может быть затруднена, но использование очищающего раствора и конфокального оптического секционирования помогает облегчить эти трудности визуализации. Таким образом, мы демонстрируем метод получения однородных сфероидов, инкапсуляции их в гидрогели ПЭГ и проведения конфокальной микроскопии на инкапсулированных сфероидах для изучения роста сфероидов и различных взаимодействий между клеткой и матриксом.

Введение

Опухолевые сфероиды оказались полезными инструментами in vitro при изучении этиологии, патологии и реакции на лекарственные препараты¹. Традиционно сфероиды культивировались в таких условиях, как пластины с низкой адгезией или биореакторы, где клеточная адгезия предпочтительнее клеточной адгезии². Тем не менее, в настоящее время признано, что для более точного повторения микроокружения опухоли сфероидные модели in vitro должны охватывать как межклеточные, так и межклеточные матриксные взаимодействия. Это побудило несколько групп разработать каркасы, такие как гидрогели, в которых сфероиды могут быть инк....

протокол

1. Приготовление растворов

1. Приготовление раствора-прекурсора полидиметилсилоксана (ПДМС)
   1. Приготовьте негативный раствор прекурсора PDMS (также используется для раствора прекурсора клея). Зачерпните эластомер в лодку для весов с помощью шпателя и взвесьте его. Добавьте отвердитель к эластомерному основанию в соотношении 1:10. Осторожно и тщательно смешайте PDMS и отвердитель с помощью шпателя в пластиковой весовой лодке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор прекурсора PDMS заливается в 6-луночную квадратную пирамидальную микролунку для формирования отрицательной формы. Это тот же раствор, который используется для раствора прекурсора клея.
   ....

Результаты

Платформы скрининга лекарственных средств на основе сфероидов для изучения химиотерапевтических эффектов становятся все более востребованными из-за акцента на модуляцию микроокружения опухоли при инкапсуляции сфероида в биоматериалах, реплицирующих нативную ткань. Здесь мы разраб.......

Обсуждение

Модели многоклеточных сфероидов опухолей на основе гидрогеля все чаще разрабатываются для продвижения терапевтических открытий в области лечения рака 11,13,29. Они полезны тем, что контролируемо эмулируют ключевые параметры микроокруж?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Fisher Scientific	LC22210-4
15 mL Conicals	FALCON	352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates	Fisher Scientific	07-200-602
35 mm Petri Dish	Amazon	706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
6-well AggreWell 400	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	34421	Square pyramidal microwells
anti-adherence rinsing solution	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free	Corning	356234	Basement membrane matrix
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Thermo Scientific	62247
Detergent - Triton-X	Sigma Aldrich	T8787	Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Hemacytometer	Bright-Line	383684
Hydrophobic solution - Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)	Fisher Scientific	D1125
Leica Confocal SP8	Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 mL: 02681258
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
Parafilm	PARAFILM	PM992
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)	Amazon	mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)	Laysan Bio	SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004	Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.	Fisher Scientific	AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)	Sigma Aldrich	90279
Trypsin 0.25% (1x)	Sigma Aldrich	SH30042.01
U-87 MG human glioblastoma cells	American Type Culture Collection	HTB-14