Fabbricazione e incapsulamento di sferoidi tumorali in idrogel di polietilenglicole per lo studio delle interazioni sferoide-matrice

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che consente la fabbricazione rapida, robusta ed economica di sferoidi tumorali seguita dall'incapsulamento dell'idrogel. È ampiamente applicabile in quanto non richiede attrezzature specializzate. Sarebbe particolarmente utile per esplorare le interazioni sferoide-matrice e costruire modelli di fisiologia o patologia tissutale in vitro .

Abstract

L'incapsulamento tridimensionale (3D) degli sferoidi è fondamentale per replicare adeguatamente il microambiente tumorale per una crescita cellulare ottimale. Qui, abbiamo progettato un modello di glioblastoma 3D in vitro per l'incapsulamento sferoidale per imitare il microambiente extracellulare del tumore. Innanzitutto, abbiamo formato stampi per micropozzetti piramidali quadrati utilizzando il polidimetilsilossano. Questi stampi per micropozzetti sono stati poi utilizzati per fabbricare sferoidi tumorali con dimensioni strettamente controllate da 50 a 500 μm. Una volta formati, gli sferoidi sono stati raccolti e incapsulati in idrogel a base di polietilenglicole (PEG). Gli idrogel PEG sono una piattaforma versatile per l'incapsulamento degli sferoidi, poiché le proprietà dell'idrogel come la rigidità, la degradabilità e l'adesività cellulare possono essere regolate in modo indipendente. In questo caso, abbiamo utilizzato un idrogel morbido rappresentativo (~8 kPa) per incapsulare gli sferoidi del glioblastoma. Infine, è stato sviluppato un metodo per colorare e visualizzare gli sferoidi per ottenere immagini di alta qualità tramite microscopia confocale. A causa del denso nucleo sferoidale e della periferia relativamente scarsa, l'imaging può essere difficile, ma l'uso di una soluzione di purificazione e di un sezionamento ottico confocale aiuta ad alleviare queste difficoltà di imaging. In sintesi, mostriamo un metodo per fabbricare sferoidi uniformi, incapsularli in idrogel PEG ed eseguire la microscopia confocale sugli sferoidi incapsulati per studiare la crescita degli sferoidi e le varie interazioni cellula-matrice.

Introduzione

Gli sferoidi tumorali sono emersi come utili strumenti in vitro nello studio dell'eziologia, della patologia e della risposta ai farmaci^{del cancro 1}. Tradizionalmente, gli sferoidi sono stati coltivati in condizioni come piastre a bassa adesione o bioreattori, in cui l'adesione cellula-cellula è favorita rispetto all'adesione cellula-superficie². Tuttavia, è ormai riconosciuto che per ricapitolare più fedelmente il microambiente tumorale, i modelli di sferoidi in vitro dovrebbero catturare sia le interazioni cellula-cellula che cellula-matrice. Ciò ha spinto diversi gruppi a progettare scaffold, come gl....

Protocollo

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparazione di una soluzione di precursore del polidimetilsilossano (PDMS)
   1. Preparare la soluzione negativa del precursore del PDMS (utilizzata anche per la soluzione del precursore della colla). Raccogli l'elastomero in una bilancia usando una spatola e pesalo. Aggiungere l'agente indurente alla base elastomerica in rapporto 1:10. Mescolare il PDMS e l'agente indurente delicatamente e accuratamente utilizzando la spatola nella bilancia di plastica.
      NOTA: Questa soluzione precursore PDMS viene versata nella piastra a micropozzetti piramidale quadrata a 6 pozzetti per formare lo stampo negativo. Quest....

Discussione

I modelli di sferoidi tumorali multicellulari basati su idrogel sono sempre più sviluppati per far progredire le scoperte terapeutiche del cancro 11,13,29. Sono utili perché emulano i parametri chiave del microambiente tumorale in modo controllato e, nonostante la loro complessità, sono più semplici ed economici da usare rispetto ai modelli in vivo e molti sono compatibili con le tecnologie di screening ad alto rendimento. I.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Fisher Scientific	LC22210-4
15 mL Conicals	FALCON	352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates	Fisher Scientific	07-200-602
35 mm Petri Dish	Amazon	706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
6-well AggreWell 400	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	34421	Square pyramidal microwells
anti-adherence rinsing solution	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free	Corning	356234	Basement membrane matrix
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Thermo Scientific	62247
Detergent - Triton-X	Sigma Aldrich	T8787	Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Hemacytometer	Bright-Line	383684
Hydrophobic solution - Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)	Fisher Scientific	D1125
Leica Confocal SP8	Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 mL: 02681258
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
Parafilm	PARAFILM	PM992
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)	Amazon	mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)	Laysan Bio	SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004	Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.	Fisher Scientific	AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)	Sigma Aldrich	90279
Trypsin 0.25% (1x)	Sigma Aldrich	SH30042.01
U-87 MG human glioblastoma cells	American Type Culture Collection	HTB-14