聚乙二醇水凝胶中的肿瘤球状体制造和封装用于研究球状体-基质相互作用

摘要

在这里，我们提出了一种方案，可以快速、稳健和廉价地制造肿瘤球体，然后进行水凝胶封装。它广泛适用，因为它不需要专门的设备。它对于探索球状体-基质相互作用和建立 体外 组织生理学或病理学模型特别有用。

摘要

球状体的三维 （3D） 封装对于充分复制肿瘤微环境以实现最佳细胞生长至关重要。 在这里，我们设计了一个用于球状体封装的 体外 3D 胶质母细胞瘤模型，以模拟肿瘤细胞外微环境。 首先，我们使用聚二甲基硅氧烷形成方形金字塔形微孔模具。然后使用这些微孔模具制造肿瘤球体，其尺寸严格控制在50-500μm之间。 一旦球状体形成，它们就会被收获并封装在聚乙二醇（PEG）基水凝胶中。PEG水凝胶是球状体封装的多功能平台，因为水凝胶的刚度、降解性和细胞粘附性等特性可以独立调节。 在这里，我们使用具有代表性的软（~8 kPa）水凝胶来封装胶质母细胞瘤球状体。 最后，开发了一种通过共聚焦显微镜获得高质量图像的球状体染色和成像方法。 由于致密的球状体核心和相对稀疏的外围，成像可能很困难，但使用透明溶液和共聚焦光学切片有助于缓解这些成像困难。 总之，我们展示了一种制造均匀球体的方法，将它们封装在PEG水凝胶中，并对封装的球体进行共聚焦显微镜检查，以研究球体生长和各种细胞-基质相互作用。

引言

肿瘤球体已成为研究癌症病因、病理学和药物反应性的有用体外工具¹。传统上，球状体是在低粘附板或生物反应器等条件下培养的，其中细胞间粘附优于细胞表面粘附²。然而，现在人们认识到，为了更忠实地概括肿瘤微环境，体外球状体模型应该同时捕获细胞-细胞和细胞-基质相互作用。这促使多个小组设计支架，例如水凝胶，其中球体可以封装^3,4。这种基于水凝胶的球状体模型能够阐明细胞-细胞和细胞-基质对各种细胞行为的相互作用，例如活力、增殖、干性或治疗反应性³。

在这里，我们描述了一种在聚乙二醇（PEG）水凝胶中封装胶质母细胞瘤球状体的方案。有多篇关于胶质母细胞瘤细胞球状体包封在水凝胶中的文献报道。例如，通过将 U87 细胞封装在装饰有 RGDS 粘附配体的 PEG 水凝胶中并与酶可裂解肽交联来形成球状体，以确定水凝胶刚度对细胞行为的影响⁵。U87细胞也已在其他基于PEG或基于透明质酸的水凝胶中形成，以扩大癌症干细胞群⁶或探索基质介导的化疗耐药机制^7,8,9<....

研究方案

1. 溶液制备

1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）前驱体溶液的制备
   1. 制备负PDMS前驱体溶液（也用于胶水前驱体溶液）。用刮刀将弹性体舀入称重舟中并称重。将固化剂以 1：10 的比例添加到弹性体基材中。使用塑料称重舟中的刮刀轻轻彻底地混合PDMS和固化剂。
      注意：将该PDMS前体溶液倒入6孔方形金字塔形微孔板中以形成负模。这与用于胶水前体溶液的溶液相同。
   2. 制备正PDMS前体溶液。用刮刀将弹性体底座舀入称重舟中并称重。将固化剂以 1：9 的比例添加到弹性体基体中。使用塑料称重舟中的刮刀轻轻彻底地混合PDMS和固化剂。
      注意：该PDMS前体溶液随后倒入负极模具上以形成正极模具。
2. pH 8的0.3 M三乙醇胺（TEA）缓冲液的制备
   1. 使用移液器辅助工具将 1 mL TEA 和 9 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 移液至 50 mL 锥形中，以制备 0.75 M TEA 溶液。使用 1 N HCl 或 1 N NaOH 将溶液滴定至 pH 值为 8。然后，加入足够的 1x PBS 以达到 25 mL 的最终体积，以达到 0.3 M 的最终 TEA 浓度，pH 值为 8。
      注意： 将 HCl 和 NaOH 溶液储存在室温 （RT） 的易燃柜中。搬运时穿戴个人防护装备。
3. 制备完整介质
   1. 要制备完整的培养基，将 10% （w/v）....

结果

基于球状体的药物筛选平台用于研究化疗效果，由于强调在复制天然组织的生物材料中球状体封装后调节肿瘤微环境，因此越来越受到追捧。在这里，我们开发了一种多细胞肿瘤球状体制备方法，随后在3D水凝胶中进行封装和成像。在微孔模具中制备球体（图3A，B），从而产生具有球形形状和严格控制的多分散性的球体。例如，对于每个微孔有 3,300 个细胞的球?.......

讨论

基于水凝胶的多细胞肿瘤球状体模型正在越来越多地被开发，以推进癌症治疗的发现11,13,29。它们是有益的，因为它们以可控的方式模拟肿瘤微环境的关键参数，尽管它们很复杂，但比体内模型更简单、更便宜，并且许多与高通量筛选技术兼容。水凝胶生物材料可以被调整以模拟肿瘤细胞外基质并促进细胞-基质相互作用，而球.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Fisher Scientific	LC22210-4
15 mL Conicals	FALCON	352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates	Fisher Scientific	07-200-602
35 mm Petri Dish	Amazon	706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
6-well AggreWell 400	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	34421	Square pyramidal microwells
anti-adherence rinsing solution	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free	Corning	356234	Basement membrane matrix
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Thermo Scientific	62247
Detergent - Triton-X	Sigma Aldrich	T8787	Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Hemacytometer	Bright-Line	383684
Hydrophobic solution - Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)	Fisher Scientific	D1125
Leica Confocal SP8	Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 mL: 02681258
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
Parafilm	PARAFILM	PM992
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)	Amazon	mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)	Laysan Bio	SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004	Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.	Fisher Scientific	AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)	Sigma Aldrich	90279
Trypsin 0.25% (1x)	Sigma Aldrich	SH30042.01
U-87 MG human glioblastoma cells	American Type Culture Collection	HTB-14