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要約

ここでは、腫瘍スフェロイドの迅速、堅牢、低コストな作製とそれに続くハイドロゲルカプセル化を可能にするプロトコルを紹介します。特殊な機器を必要としないため、広く適用できます。特に、スフェロイドとマトリックスの相互作用を探索したり、 in vitro 組織生理学や病理学モデルを構築したりするのに有用です。

要約

スフェロイドの3次元(3D)カプセル化は、最適な細胞増殖のために腫瘍微小環境を適切に再現するために重要です。 ここでは、腫瘍の細胞外微小環境を模倣するために、スフェロイドカプセル化用の in vitro 3D神経膠芽腫モデルを設計しました。 まず、ポリジメチルシロキサンを用いて四角錐型のマイクロウェルモールドを作製した。次に、これらのマイクロウェルモールドを使用して、50〜500μmのサイズを厳密に制御した腫瘍スフェロイドを製造しました。 スフェロイドが形成されると、スフェロイドを回収し、ポリエチレングリコール(PEG)ベースのハイドロゲルにカプセル化しました。PEGハイドロゲルは、硬さ、分解性、細胞接着性などのハイドロゲル特性を独立して調整できるため、スフェロイドカプセル化のための汎用性の高いプラットフォームです。 ここでは、代表的な軟質(~8 kPa)ハイドロゲルを使用して、膠芽腫スフェロイドをカプセル化しました。 最後に、共焦点顕微鏡で高品質の画像を得るために、スフェロイドを染色して画像化する方法が開発されました。 スフェロイドコアが緻密で周辺が比較的まばらなため、イメージングが困難な場合がありますが、透明化溶液と共焦点光学セクショニングを使用することで、これらのイメージングの困難さを軽減することができます。 要約すると、均一なスフェロイドを作製し、それらをPEGハイドロゲルにカプセル化し、カプセル化されたスフェロイドに対して共焦点顕微鏡法を実行して、スフェロイドの成長とさまざまな細胞とマトリックスの相互作用を研究する方法を示します。

概要

腫瘍スフェロイドは、がんの病因、病理学、および薬物反応性を研究する上で有用なin vitroツールとして浮上しています1。従来、スフェロイドは、細胞表面の接着よりも細胞間の接着が好まれる低接着プレートやバイオリアクターなどの条件で培養されてきました2。しかし、腫瘍の微小環境をより忠実に再現するために、in vitroスフェロイドモデルは細胞間相互作用と細胞マトリックス相互作用の両方を捉える必要があることが現在認識されています。このため、複数のグループが、スフェロイドをカプセル化できるハイドロゲルなどの足場を設計するようになりました3,4。このようなハイドロゲルベースのスフェロイドモデルは、生存率、増殖、幹細胞性、治療反応性など、さまざまな細胞挙動における細胞間および細胞マトリックス相互作用の解明を可能にします3。

ここでは、ポリエチレングリコール(PEG)ヒドロゲルに神経膠芽腫スフェロイドをカプセル化するためのプロトコルについて説明します。ヒドロゲルへの膠芽腫細胞スフェロイドのカプセル化に関する複数の文献報告があります。例えば、スフェロイドは、U87細胞をRGDS接着性リガンドで装飾したPEGハイドロゲルに封入し、酵素的に切断可能なペプチドで架橋して形成し、ハイドロゲルの硬さが細胞挙動に及ぼす影響を決定しました5。U87細胞は、がん幹細胞集団を拡大したり6、化学療法耐性のマトリックスを介したメカニズムを探求したりするために、他のPEGベースまたはヒアルロン酸ベースのハイドロゲルでも形成されています7,8,9。神経膠芽腫スフェロイドは、ミクログリア細胞とがん細胞の間のクロストークおよび細胞浸潤に対するその影響を研究するために、ゼラチンハイドロゲルにもカプセル化されている10。全体として、このような研究は、膠芽腫の病理学を理解し、治療法を考案する上でのハイドロゲルベースのin vitroモデルの有用性を実証しています。

さらに、腫瘍スフェロイドの作製およびヒドロゲルカプセル化には異なる方法がある11。例えば、分散した細胞をハイドロゲルに播種し、時間をかけてスフェロイドを形成することができる5,12。このような方法の欠点の1つは、形成されたスフェロイドの多分散性であり、細胞応答の違いにつながる可能性があります。均一なスフェロイドを産生するために、細胞をマイクロゲルに封入し、それらがゲルに侵入してリモデリングするまで長期間培養するか13、または細胞を球状の「穴」を有する鋳型ゲルに堆積させ、凝集させることができる14。これらの方法の欠点は、相対的に複雑であること、マイクロゲルまたはゲル内の「穴」を形成するために液滴発生器またはその他の手段が必要であること、およびスフェロイドが成長して成熟するのにかかる時間です。あるいは、スフェロイドは、マイクロウェル9,15,16または吊り下げ式プレート17,18で予め形成され、次いで、ここに記載される技術と同様に、ハイドロゲルにカプセル化されてもよい。これらの方法はより単純で、より高いスループットで実行できます。興味深いことに、スフェロイド形成の方法は、遺伝子発現、細胞増殖、薬物応答性などのスフェロイド細胞の挙動に影響を与える可能性があることが示されています19,20。

ここでは、膠芽腫が固形腫瘍であり、その本来の環境は柔らかいナノ多孔質の脳マトリックス21であり、柔らかいナノ多孔質のハイドロゲルによって模倣することができるため、神経膠芽腫に焦点を当てる。神経膠芽腫は、利用可能な治療法がない最も致命的な脳腫瘍でもあります22。しかし、ここで説明するプロトコルは、あらゆる固形腫瘍を表すスフェロイドのカプセル化に用いることができる。我々は、マイケル型付加反応によって形成されるPEGハイドロゲルを使用することを選択しました23。PEGは、合成された、非分解性で、生体適合性のヒドロゲルであり、不活性であり、足場および物理的な細胞支持体として機能するが、細胞接着は支持しない23。細胞の接着性は、全タンパク質または接着性リガンドのテザリングを介して別個に付加することができ24、分解性は、PEGポリマー鎖の化学修飾または加水分解的または酵素的に分解可能な架橋剤25,26を介して付加することができる。これにより、生化学的特性を機械的または物理的なハイドロゲル特性とは無関係に調整することができ、細胞とマトリックスの相互作用を研究する上で有利になる可能性があります。マイケル型ゲル化化学は選択的であり、生理学的条件で起こります。したがって、スフェロイドをハイドロゲル前駆体溶液と混合するだけで、スフェロイドのカプセル化が可能になります。

全体として、ここで紹介する方法論にはいくつかの注目すべき特徴があります。まず、マルチウェルアセンブリでの腫瘍スフェロイドの作製は効率的で迅速であり、必要な材料のコストは低く抑えられます。第二に、回転楕円体は、多分散性の低いさまざまなサイズで大量に製造されます。最後に、市販の材料のみが必要です。この方法論の有用性は、スフェロイド細胞の生存率、真円度、および細胞幹細胞性に対する基質特性の影響を調べることによって示されています。

プロトコル

1. 溶液の準備

  1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)前駆体溶液の調製
    1. ネガティブPDMS前駆体溶液(接着剤前駆体溶液にも使用)を調製します。ヘラを使ってエラストマーを計量ボートにすくい入れ、計量します。硬化剤をエラストマーベースに1:10の比率で添加します。プラスチック製の計量ボートのスパチュラを使用して、PDMSと硬化剤を穏やかに完全に混合します。
      注:このPDMS前駆体溶液を6ウェル四角錐型マイクロウェルプレートに流し込み、ネガティブモールドを形成します。これは、接着剤前駆体溶液に使用されるのと同じ溶液です。
    2. ポジティブPDMS前駆体溶液を調製します。エラストマーベースをヘラを使って計量ボートにすくい入れ、計量します。硬化剤をエラストマーベースに1:9の比率で添加します。プラスチック製の計量ボートのスパチュラを使用して、PDMSと硬化剤を穏やかに完全に混合します。
      注:このPDMS前駆体溶液は、後でネガ型に流し込まれ、ポジ型を形成します。
  2. pH 8の0.3 Mトリエタノールアミン(TEA)緩衝液の調製
    1. 1 mL の TEA と 9 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を 50 mL のコニカル液にピペットで移動し、0.75 M TEA 溶液を調製します。1 N HClまたは1 N NaOHを使用して溶液をpH 8に滴定します。次に、最終容量が 25 mL になるように十分な 1 x PBS を添加し、最終 TEA 濃度 0.3 M、pH 8 にします。
      注意: HClおよびNaOH溶液は、室温(RT)で可燃性キャビネットに保管してください。取り扱いの際は個人用保護具を着用してください。
  3. 完全な培地の調製
    1. 完全な培地を調製するには、10%(w/v)または56 mLのウシ胎児血清と1%(w/v)または5.6 mLのペニシリンおよびストレプトマイシンを500 mLのRPMI培地に加えます。
    2. 使用前に溶液を37°Cで10〜20分間、または溶液が温まるまで置きます。
    3. 溶液を0〜4°Cで最大6か月間保存します。
  4. 20%(w/v)ポリエチレングリコール(PEG)原液の調製
    注:計算は 100 μL の溶液に基づいており、必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンできます。
    1. 20% w/v 4アームPEG-Acrylate(4アームPEG-Ac)の100 μLストック溶液を調製するには、20 mgの4アームPEG-Ac粉末をマイクロチューブで秤量します。70 μL の 0.3 M TEA バッファーを添加し、溶液を約 30 秒間、または完全に溶解するまでボルテックスします。粉末の溶解による体積変化を考慮し、最終溶液容量が100 μLに達するのに十分なTEAバッファー(~27 μL)を添加します。
    2. 20% w/v PEG-diSH の 100 μL ストック溶液を調製するには、20 mg の PEG-diSH 粉末を微量チューブで秤量します。70 μLのTEA緩衝液を添加し、溶液を約30秒間、または完全に溶解するまでボルテックスします。粉末の溶解による体積変化を考慮し、最終溶液容量が100 μLに達するのに十分なTEAバッファー(~27 μL)を添加します。
      注:PEG粉末は非常に吸湿性があり、-20°Cの乾燥容器に保管する必要があります。 冷凍庫から取り出すときは、PEG粉末を10分間解凍してから、ボトルを開けて粉末の重量を量ります。ボトルを窒素やアルゴンなどの不活性ガスでパージして湿った空気を置き換えてから、冷凍庫に戻します。4アームPEG-ACの原液は、使用前に4°Cで最大2週間保存できます。PEG-diSHの原液は使用直前に調製する必要があり、チオール基同士が反応してジスルフィド結合を形成するため保存できません。
  5. 2% v/v基底膜マトリックス溶液の調製
    1. 2% v/v 基底膜マトリックスワーキング溶液を調製するには、20 μL の基底膜マトリックス(LDEV フリー)を 9.98 mL の完全培地に添加し、ピペッティングで上下に ~10 回混合して完全に混合します。溶液を4°C(氷上)で調製し、37°C(オーブンまたはインキュベーター)に温めてすぐに使用してください。
      注:基底膜マトリックスは>10°Cでゲルを形成し始めるため、必ず2〜6°Cで基底膜マトリックス溶液を完全な培地と混合してください。 完全なメディア構成は、ステップ1.3で説明します。
  6. 細胞固定液の調製
    1. 4% w/v のパラホルムアルデヒドと 0.1% v/v の非イオン性界面活性剤を含む 1 mL の細胞固定液を調製するには、まず 891 μL の 1x PBS と 108 μL のパラホルムアルデヒド (37% w/v 濃度) を混合し、次に 1 μL の非イオン性界面活性剤 (100% 濃度) を添加します。溶液を完全に混合します。
      注意: 固定液は、固定を行うたびに新しくする必要があります。
      注意: パラホルムアルデヒドは可燃性であり、空気中に可燃性の粉塵濃度を形成する可能性があります。皮膚の炎症や深刻な目の損傷を引き起こします。息を吸うと呼吸器への刺激を引き起こす可能性があるため、避けてください。パラホルムアルデヒドを化学ドラフトで処理し、個人用保護具を着用してください。取り扱い後はよく手を洗ってください。非イオン性界面活性剤は、皮膚の炎症や深刻な目の損傷を引き起こします。取り扱いの際は、保護手袋と目の保護具または顔の保護具を着用してください。環境への放出を避けるために、化学ヒュームフードでボトルを開けてください。取り扱い後はよく手を洗ってください。
  7. 染色液の調製
    1. 3 mM の 3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物(DiOC)を調製するには、2.65 mg の DiOC を 1 mL の DMSO に混合します。
    2. 1.5 mM のヨウ化プロピジウム溶液(PI)を調製するには、1 mg の PI を 1 mL の脱イオン水に混合します。
  8. スフェロイド除去溶液の調製
    1. スフェロイド透明化用に、1x PBS中の20%、40%、80%v/vのホルムアミドの透明化溶液を調製します。
      1. 10 mL の 20% v/v ホルムアミドを調製するには、8 mL の 1x PBS とそれに続く 2 mL のホルムアミドを混合します。10 mL の 40% v/v ホルムアミドを調製するには、6 mL の 1x PBS とそれに続く 4 mL のホルムアミドを混合します。10 mL の 80% v/v ホルムアミドを作るには、2 mL の 1x PBS と続いて 8 mL のホルムアミドを混合します。
      2. ホルムアミドと1x PBSを混合した後、約30秒間ボルテックスして溶液を混合します。

2. 角錐型マイクロウェルの作製

  1. 図1に示すように、正方形のピラミッド型マイクロウェルのネガティブPDMSモールドを作製します。
    1. 2 g(~1 mL)のネガティブPDMS前駆体溶液を調製し、6ウェル四角錐型マスターモールドの1つのウェルに注ぎます。1 mLはプレートの1つのウェルを完全に覆うことに注意してください。マスターモールドをPDMSで覆った後、6ウェル角錐型プレートを真空デシケーターに入れて、PDMS前駆体溶液を30分間脱気します。次に、プレートを60°Cのオーブンに24時間入れてPDMSを硬化させます。
      注意: 脱気のためにプレートの蓋を取り外し、硬化のために元に戻してください。真空デシケーターで、または窒素やアルゴンなどの不活性ガスでパージして溶液を脱気します。30分経っても負型前駆体溶液に気泡が残っており、脱気が不十分であることを示す場合は、真空デシケーターにさらに30分間入れます。1つまたは複数のプレートウェルを同時に使用して、1つ以上のPDMSネガティブモールドを準備します。 表1に示すように、一辺の長さが400μmおよび800μmなど、異なるサイズの正方形のピラミッド型マイクロウェルを使用することができる。正方形のピラミッド型のサイズに関係なく、同じ量の PDMS が使用されます。
    2. 温かいうちにPDMSが硬化したら、ヘラを使ってマスターモールドからネガ型PDMS型を慎重に取り出し、生検パンチを用いて直径35mmのスラブにネガ型を切断します。ペトリ皿に入れ、蓋をして、さらに24時間RTを硬化させ続けます。
      注意: ネガモールドを除去するには、スパチュラを使用してウェルプレートとPDMSモールドの間に入り、ネガモールドをマスターモールドからそっと引き出します。型は、35mmのシャーレに合うように35mmのスラブに切断されます。金型は、異なる直径のプレートに合うように他のサイズで作成できます。35mmのネガ型スラブは、RTで埃から保護して保管し、6ヶ月間再利用することができます。
  2. 正方形のピラミッド型マイクロウェルのポジティブPDMSモールドを準備します。
    1. ネガティブPDMSモールドの35mmスラブを、テクスチャード加工されたマイクロウェルを上に向けて35mmシャーレに入れます。
    2. 上記のように2.5g(~1.2 mL)の陽性PDMS前駆体溶液を調製し、35 mmシャーレの陰性型に注ぎ、陰性型を完全に覆います。次に、上記のように前駆体溶液を30分間脱気し、60°Cのオーブンに3〜4時間入れます。
      注:PDMSは粘性があるため、ネガモールドの下に閉じ込められた空気から気泡が形成される可能性があります。ネガ型の下に気泡ができたら、へらを使って型をそっと押し下げて気泡を放出します。気泡が残っている場合は、30分間脱気を続けるか、へらを取り、気泡がはじけるまでポジティブモールド溶液を静かに攪拌します。
    3. ポジ型PDMSの型が硬化したら、35mmのシャーレから型を取り出し、すぐにポジ型をネガ型から剥がします。
      注意: ポジ型をうまく剥がすには、タイミングが重要です。除去は、カミソリを使用してポジ型にわずかに切り込みを入れ、ポジ型とネガティブ型の界面を露出させ、型を互いに剥がすことによって行うのが最適です。次に、円形の型の端をはがします。プラス型からネガ型をそっとはがします。
  3. 48ウェルプレートのウェルの底に型を接着します。
    注: ここでは 48 ウェル プレートを使用しますが、モールド スラブが正しい直径に切断されている限り、他のプレートを使用できます (たとえば、96 ウェル プレートの場合は直径 6 mm)。
    1. 10mmの生検パンチを使用して、ポジティブモールドをスラブに切断します。
      注:直径35mmのポジ型1つから約4つの金型(直径10mm)を切断できます。
    2. 金型を48ウェルプレートの底に接着するには、前述のようにPDMS接着剤前駆体溶液(~0.5 mLまたは1 g)を調製します27。ピンセットを使用して、10 mmポジ型モールドの平らな面(マイクロウェルのパターンがある側ではない)をPDMS前駆体溶液に静かに浸します。48ウェルプレートのウェルごとに1つの型を慎重に配置し、ピンセットを使用して各型をウェルの底にそっと押し込みます。組み立てたプレートを60°Cのオーブンに4〜24時間入れて、PDMS接着剤を硬化させます。
      注:PDMS接着剤前駆体溶液がポジティブモールドマイクロウェルに付着した場合は、軟ティッシュペーパーを使用して拭き取り、ステップを繰り返すことができます。接着するときは、接着剤がマイクロウェルを覆っていないことを確認してください。
    3. 1000μLのピペットを使用して、48ウェルプレートの各ウェルに300μLの70%エタノールを添加して金型を滅菌します。70%エタノールを吸引し、蓋をしていない48ウェルプレートを組織培養フードに入れ、UV(302 nm)下で2時間置きます。
      注:金型は6か月間使用でき、必要に応じて再滅菌できます。

3. 多細胞腫瘍スフェロイドの形成、採取、ハイドロゲルへのカプセル化

注:このセクションで概説するプロトコルは、U87ヒト膠芽腫細胞株用ですが( 図1 および 図2を参照)、同様のプロトコルを他のがん細胞タイプでも使用できます。

  1. 多細胞腫瘍スフェロイド形成
    1. 1000 μLのピペットを使用して各ウェルに300 μLの溶液を添加することにより、最初に付着防止リンス溶液でマイクロウェル金型を洗浄します。その後、1620 x g で3分間遠心分離し、真空ポンプとパスツールピペットを使用して溶液を吸引します。
      注:このステップは、セル播種の直前に実行してください。
    2. 培養フラスコ領域の各cm2 あたり~80μLの0.25%トリプシン/EDTAに細胞を37°Cで5分間曝露します。 例えば、1 mLのトリプシン/EDTAはT-25細胞培養フラスコに適しています。同量の完全細胞培養培地を添加してトリプシンを中和します。例えば、トリプシン含有T-25細胞培養フラスコに1 mLの完全培地を加えます。組織培養フラスコから細胞を回収します。
    3. 10 μLの細胞懸濁液を血球計算盤の各ポートに移し、細胞をカウントします。倒立顕微鏡を使用して細胞の総数をカウントし、少なくとも8つの象限からその細胞数を平均し、各血球計算盤の象限の細胞数が20〜50になるようにして、良好な細胞数結果を得ることができます。計算された数値に104 を掛けて、最終的な細胞濃度を決定します。
    4. 表1に示すように、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した完全なRPMI細胞培養培地に、所望の最終細胞濃度で回収した細胞を再懸濁します。
      注:800 μm のマイクロウェルは、48 ウェルプレートの 1 つのウェルで ~75 のスフェロイドを生成し、400 μm のマイクロウェルは、48 ウェルプレートの 1 つのウェルで ~300 のスフェロイドを生成します。
    5. 500 μLの細胞懸濁液を所望の濃度でマイクロウェルに入れ、プレートを1620 x g で3分間遠心分離します。プレートを加湿したインキュベーターに37°C、5%CO2 で24時間入れ、スフェロイドを形成します。
      注:スフェロイドが形成されない場合は、2% v/vの基底膜マトリックスと完全な培地を組み合わせて細胞を再懸濁することができます(詳細はステップ1.5を参照)。
  2. スフェロイドの採取
    1. 1000μLのピペットを使用して、500μLの完全培地をウェルにしっかりとピペットで移します。ウェルから採取した培地500 μLを使用して、ウェルの4つの象限(具体的には上部、下部、左右の象限)を3〜4回ピペッティングして洗浄し、スフェロイドを取り除きます。スフェロイドを含む培地(合計~1000 μL)を1000 μLのピペットを使用して微量遠心チューブに静かに吸引し、スフェロイドが底に沈殿するのを待ちます。
    2. 上清を除去し、スフェロイドを所望の最終濃度に再懸濁します。例えば、カプセル化後に 20 μL のゲル中に ~8 個のスフェロイドを得るには、スフェロイドを 100 μL の培地に再懸濁し、スフェロイド懸濁液中のスフェロイド濃度を ~75 μSphereid/100 μL にします。
  3. スフェロイドのハイドロゲルへのカプセル化( 図2参照)。
    1. 100 μL の 10% w/v PEG ハイドロゲル前駆体溶液を調製するには、50 μL のスフェロイド懸濁液、続いて 30 μL の 20% w/v 4 アーム PEG-Ac、最後に 20 μL の 20% w/v PEG-diSH を微量遠心チューブに入れます。これにより、アクリレート(Ac)基とチオール(SH)基の確率論的なモル比が得られ、最適な架橋が保証されます。ゲル前駆体溶液をピペッティングで上下に~10回混合します。
      注:ハイドロゲルの組成、容量、およびポリマーの協奏は、必要に応じて変更できます。結果として得られるハイドロゲルはゆっくりと分解され、非細胞接着剤になります。ヒドロゲル細胞を接着剤にするために、RGDSなどの接着性リガンドを添加することができる。ヒドロゲルを酵素的に分解可能にするために、両末端にシステイン残基を含む酵素分解性ペプチド架橋剤を添加することができる。スフェロイドを移すときは、溶液を2回静かにピペットで移し、スフェロイドを取り除き、懸濁液にしてスフェロイドが均一に分布するようにします。
    2. 1 mmシリコンスペーサーで分離した2枚のパラフィルム裏地ガラススライドの間にゲル前駆体溶液20 μLをピペットで移し、ゲル前駆体溶液を含むスライドを37°C、5%CO2 インキュベーターに15分間入れてゲル化させます。
      注:2枚のスライドガラスがパラフィルムで覆われていることを確認し、ゲル化時に簡単に剥がせるように疎水性の表面を作成します。パラフィルムの代わりに、疎水性コーティング溶液を使用することができる。20 μLの容量のヒドロゲル前駆体溶液は、膨潤前に直径~6 mm、高さ1 mmのヒドロゲルスラブになります。スペーサーの種類と厚さは問いませんが、ゲルの厚さは1 mm以下に保ち(ハイドロゲルを厚くすると、酸素の拡散と細胞への栄養素の輸送が制限される可能性があります)、スフェロイドの直径よりも大きくすることをお勧めします(スフェロイドがゲルに完全にカプセル化されるように)。任意の量のヒドロゲル前駆体溶液を使用することができる。20〜30μLのゲルは、24ウェルプレートに適しています。
    3. ハイドロゲルのゲル化が完了したら、2枚のスライドガラスを分離し、ヘラを使ってガラス板からゲルをそっと剥がします。ゲルを24ウェルプレートに1ウェルにつき1枚ずつ入れ、スフェロイドを含む表面が上を向くようにします。
      注:スフェロイドはゲル化中にゲルの底に落ちるため、培養のためにスフェロイドを反転させると、スフェロイドがハイドロゲルの表面近くに確実になり、栄養素と酸素へのアクセスが良くなります。ゲル化は、微量遠心チューブ内に残っているヒドロゲル前駆体溶液を観察することで監視でき、チューブを反転させ、ゲルが流れを停止する時間を記録することでスラブの作成には使用されません。
    4. 各ウェルに完全な培地(~500 μL)を添加し、ハイドロゲルが完全に浸されていることを確認します。マルチウェルプレートを加湿インキュベーターに37°C、5%CO2 で入れ、2〜3日ごとに培地を交換して細胞を培養します。
      注:ハイドロゲルは、最大4週間、またはヒドロゲルが分解されるまで培養し、1日おきに培地を交換することができます。

4. 蛍光染色

  1. 細胞生存率
    1. すべての細胞のミトコンドリアと小胞体を染色する染色剤3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物(DiOC)を使用して、細胞の生存率を決定します。DiOC(3 mM)は0.02 μg/mLの濃度でご使用ください。具体的には、20 μLのピペットを使用して、培地1000 μLあたり2 μLのDiOCをフラスコに添加し、解離した細胞を培養します(セクション3のスフェロイド形成プロセスの少なくとも24時間前)。DiOCが細胞を染色するまで24時間待ちます。
    2. 死細胞のみに入る核染色および染色体染色剤、ヨウ化プロピジウム、PI(1.50 mM)を使用します。細胞を染色するには、まずすべての培地を吸引し、1000 μLのピペットを使用して500 μLの1x PBSを加えてゲルをすすぎ、ゲルが完全に浸漬するようにします。
    3. PBSを吸引し、500 μLの新鮮な培地を添加し、続いて30 μLのPI溶液を各ウェルに添加します(つまり、培地100 μLあたり6 μL)。ウェルプレートをアルミホイルで覆い、光から保護します。ウェルプレートを37°C、5%CO2 のインキュベーターに入れ、PIが死細胞を染色するまで30分間待ちます。
    4. ホイルを取り除き、ウェルから培地を吸引します。1000 μL のピペットを使用して、500 μL の 1x PBS を添加し、ハイドロゲルを浸します。1x PBSを吸引し、すすぎをさらに2回繰り返します。各ウェルに培地500 μLを添加し、蛍光倒立顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化します。
    5. 共焦点顕微鏡または倒立蛍光顕微鏡のzスタック画像を使用して、式1で表されるように、DiOC(すべての細胞)とPI(死細胞)の面積を比較することにより、細胞生存率を計算します。
      figure-protocol-9732 式1.

5. カプセル化されたスフェロイドの免疫蛍光固定、染色、透明化、イメージング

  1. 固定と染色
    1. ハイドロゲルを培養するウェルから培地を吸引し、500 μL の 1x PBS をハイドロゲルに直接ピペッティングしてハイドロゲルをすすぎます。1x PBSを静かに吸引します。
    2. 1000 μLのピペットを使用してスフェロイドを24ウェルプレートに固定し、ウェルあたり500 μLの容量の固定液を添加します。固定液を室温で30分間ゲルに浸し、1000 μLのピペットを使用して固定液を除去し、指定の廃液容器に廃棄します。
    3. 各ウェルに 500 μL の 1x PBS を添加して、ハイドロゲルをすすぎます。1000 μLのピペットを使用して1x PBSを吸引し、PBSリンスをさらに2回繰り返します。ウェルプレートは、ウェルあたり500 μLの1x PBSを4°Cで最大1週間保存するか、すぐに使用してください。
      注:PBSと固定液を吸引するときは、ハイドロゲルをピペットに引き込まないように注意してください。プレートを~45度の角度に傾けると、ハイドロゲルが見えやすくなり、誤嚥を防ぐことができます。
      注意: ホルムアルデヒドは、吸入および接触すると有毒です。化学ドラフト内の手袋で取り扱ってください。
    4. 細胞を染色するには、ハイドロゲルでカプセル化したスフェロイドを、ネスチン(200 μg/mL)およびSOX2(200 μg/mL)の一次抗体と、希釈倍率1:200の抗体:PBSでインキュベートします。1000 μLのピペットを使用して、ウェルから1x PBSを吸引します。希釈した抗体を50 μLずつ各ウェルに添加します。染色が完了するまで24時間待ちます。その後、1000μLのピペットで染色液を除去し、廃液を適切に廃棄してください。
    5. 1000 μLのピペットを使用して、ハイドロゲルを沈めるのに十分な500 μLの1xPBSを加えます。PBSを吸引し、さらに2回繰り返します。染色して浸したハイドロゲルを1x PBSで4°C、最大2週間保存してから、イメージングまたはイメージングを直ちに行ってください。
      注:適切な染色を確実にするために、抗体によっては軽微な最適化が必要な場合があります。濃度(1:200)と時間(24時間)は、3D染色にはハイドロゲルとスフェロイドを介した拡散が必要なため、一般的な2D単層細胞培養よりも大幅に高くなります。
  2. スフェロイドを染色した後、スフェロイドを透明化し、PBSをホルムアミドの連続濃度増加(オプション)に置き換えてイメージングの透明性を向上させます。
    1. 各ウェルから1x PBSを吸引します。500 μLの20%(v/v)ホルムアミドを各ウェルに添加し、ハイドロゲルを90分間インキュベートします。1000μLのピペットでホルムアミドを吸引し、廃液容器に回収します。
    2. 500 μL の 40% (v/v) ホルムアミドをウェルに加えます。ヒドロゲルを溶液中で90分間インキュベートします。ホルムアミドを吸引し、廃棄物容器に廃棄物を回収します。
    3. 500 μL の 80% v/v ホルムアミドを各ウェルに添加し、90 分間インキュベートします。ホルムアミドを吸引し、廃液容器に廃棄する。500 μLの100%(v/v)ホルムアミドを添加し、24時間インキュベーションしてからイメージングします。除去が終了したら、実験室廃棄物管理システムの適切なサービスを通じてホルムアミド廃棄物を適切に処分します。
      注:クリアリングは、回転楕円体のコアへの共焦点イメージングを可能にし、回転楕円体の周辺部のみを調査する場合はオプションです。
  3. 共焦点顕微鏡を用いたハイドロゲル内包スフェロイドのイメージング。
    注:倒立顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡など、あらゆる顕微鏡を細胞イメージングに使用できます。ただし、共焦点では、単一の平面を分離できます。
    1. ハイドロゲルをガラス製のカバーガラス底部を備えたチャンバーウェルに置き、スフェロイドをカバーガラスにできるだけ近づけて配置します。
      注:ガラスカバーガラスまたはガラスカバーガラス底部を備えたチャンバー付きウェルを使用できます。ハイドロゲルを水和させておくことは、サンプルを脱水するとイメージング品質が低下するため、非常に重要です。
    2. 長作動距離対物レンズ(10倍〜20倍)でサンプルを画像化し、3D再構成用のZスタックを使用して回転楕円体の奥深くまでイメージングできるようにします。
      注:高倍率の対物レンズは、より詳細なイメージングと光学セクショニングを可能にしますが、画像の深さを犠牲にします。
    3. 式 2 を使用して、クリアされた信号とクリアされていない信号の両方について、回転楕円体の総面積に対する光セクションに存在する信号の量を定量化します。
      figure-protocol-12081 式2

結果

化学療法効果を研究するためのスフェロイドベースの薬物スクリーニングプラットフォームは、天然組織を複製する生体材料にスフェロイドをカプセル化する際に腫瘍微小環境を調節することに重点が置かれているため、ますます求められています。ここでは、多細胞腫瘍スフェロイドの調製と、その後の3Dハイドロゲルへのカプセル化とイメージングの方法を開発しました。スフェロイド?...

ディスカッション

ハイドロゲルベースの多細胞腫瘍スフェロイドモデルは、がん治療の発見を前進させるためにますます開発されています11,13,29。これらは、制御された方法で腫瘍微小環境の主要なパラメータをエミュレートし、その複雑さにもかかわらず、in vivoモデルよりもシンプルで安価に使用でき、多くがハイスループットスクリー...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、セントルイス大学からSilviya P Zustiak博士に提供されたスタートアップ資金と、セントルイス大学のHenry and Amelia Nasrallah Center for NeuroscienceからSilviya P Zustiak博士に授与されたシード助成金によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
70% EthanolFisher Scientific LC22210-4
15 mL ConicalsFALCON352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment platesFisher Scientific07-200-602
35 mm Petri DishAmazon706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL ConicalsFisher Scinetific3181345107
6-well AggreWell 400 StemCell Technologies, Vancouver, Canada34421Square pyramidal microwells 
anti-adherence rinsing solutionStemCell Technologies, Vancouver, CanadaCat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptideGenic Bio, Shanghai, Chinan/aCustom synthesis
Chemical Fume HoodKEWAUNEE99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free Corning356234Basement membrane matrix
Detergent - Triton-XSigma AldrichT8787Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Fisher Scinetific1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30073-03
Formaldehyde 37% SolutionSigma AldrichF1635
Glass PlatesSlumpysGBS4100SFSL
Glass Transfer PipettesFisher Scinetific5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptideGenic Bio, Shanghai, Chinan/aCustom synthesis
HemacytometerBright-Line383684
Hydrophobic solution - Repel Silane GE Healthcare Bio-Sciences17-1332-01
IncubatorNUAIRENU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)Zeiss663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)Fisher Scientific D1125
Leica Confocal SP8Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)Zeiss3820005619
Micro centrifuge tubesFisher Scientific2 mL: 02681258
Microscope SoftwareZeissAxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594 Santa Cruz Biotechnologysc-23927
ParafilmPARAFILM PM992
PBS (1x), pH 7.4HyCloneSH30256.01
Penicillin StreptomycinMP Biomedicals1670046
Pipette AidDrummond Scientific Co.P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)Fisher Scinetific2707509
Plastic Standard Disposable Transfer PipettesFisher Scientific13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)Amazon mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)Laysan BioSH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]Elsworth Adhesives3097358-1004Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination GlovesQuest92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln. Fisher Scientific AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)HyCloneSH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cmGrace Bio-LabsJTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnologysc-365823
Tissue Culture HoodNUAIRENU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC) Sigma Aldrich90279
U-87 MG human glioblastoma cellsAmerican Type Culture Collection HTB-14

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