スフェロイド-マトリックス相互作用研究のためのポリエチレングリコールハイドロゲルにおける腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化

要約

ここでは、腫瘍スフェロイドの迅速、堅牢、低コストな作製とそれに続くハイドロゲルカプセル化を可能にするプロトコルを紹介します。特殊な機器を必要としないため、広く適用できます。特に、スフェロイドとマトリックスの相互作用を探索したり、 in vitro 組織生理学や病理学モデルを構築したりするのに有用です。

要約

スフェロイドの3次元(3D)カプセル化は、最適な細胞増殖のために腫瘍微小環境を適切に再現するために重要です。 ここでは、腫瘍の細胞外微小環境を模倣するために、スフェロイドカプセル化用の in vitro 3D神経膠芽腫モデルを設計しました。 まず、ポリジメチルシロキサンを用いて四角錐型のマイクロウェルモールドを作製した。次に、これらのマイクロウェルモールドを使用して、50〜500μmのサイズを厳密に制御した腫瘍スフェロイドを製造しました。 スフェロイドが形成されると、スフェロイドを回収し、ポリエチレングリコール(PEG)ベースのハイドロゲルにカプセル化しました。PEGハイドロゲルは、硬さ、分解性、細胞接着性などのハイドロゲル特性を独立して調整できるため、スフェロイドカプセル化のための汎用性の高いプラットフォームです。 ここでは、代表的な軟質(~8 kPa)ハイドロゲルを使用して、膠芽腫スフェロイドをカプセル化しました。 最後に、共焦点顕微鏡で高品質の画像を得るために、スフェロイドを染色して画像化する方法が開発されました。 スフェロイドコアが緻密で周辺が比較的まばらなため、イメージングが困難な場合がありますが、透明化溶液と共焦点光学セクショニングを使用することで、これらのイメージングの困難さを軽減することができます。 要約すると、均一なスフェロイドを作製し、それらをPEGハイドロゲルにカプセル化し、カプセル化されたスフェロイドに対して共焦点顕微鏡法を実行して、スフェロイドの成長とさまざまな細胞とマトリックスの相互作用を研究する方法を示します。

概要

腫瘍スフェロイドは、がんの病因、病理学、および薬物反応性を研究する上で有用なin vitroツールとして浮上しています¹。従来、スフェロイドは、細胞表面の接着よりも細胞間の接着が好まれる低接着プレートやバイオリアクターなどの条件で培養され^{てきました2。}しかし、腫瘍の微小環境をより忠実に再現するために、in vitroスフェロイドモデルは細胞間相互作用と細胞マトリックス相互作用の両方を捉える必要があることが現在認識されています。このため、複数のグループが、スフェロイドをカプセル化できるハイドロゲルなどの足場を設計するようになりました^3,4。このようなハイドロゲルベースのスフェロイドモデルは、生存率、増殖、幹細胞性、治療反応性など、さまざまな細胞挙動における細胞間および細胞マトリックス相互作用の解明を可能にします³。

ここでは、ポリエチレングリコール(PEG)ヒドロゲルに神経膠芽腫スフェロイドをカプセル化するためのプロトコルについて説明します。ヒドロゲルへの膠芽腫細胞スフェロイドのカプセル化に関する複数の文献報告があります。例えば、スフェロイドは、U87細胞をRGDS接着性リガンドで装飾....

プロトコル

1. 溶液の準備

1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)前駆体溶液の調製
   1. ネガティブPDMS前駆体溶液(接着剤前駆体溶液にも使用)を調製します。ヘラを使ってエラストマーを計量ボートにすくい入れ、計量します。硬化剤をエラストマーベースに1:10の比率で添加します。プラスチック製の計量ボートのスパチュラを使用して、PDMSと硬化剤を穏やかに完全に混合します。
      注:このPDMS前駆体溶液を6ウェル四角錐型マイクロウェルプレートに流し込み、ネガティブモールドを形成します。これは、接着剤前駆体溶液に使用されるのと同じ溶液です。
   2. ポジティブPDMS前駆体溶液を調製します。エラストマーベースをヘラを使って計量ボートにすくい入れ、計量します。硬化剤をエラストマーベースに1:9の比率で添加します。プラスチック製の計量ボートのスパチュラを使用して、PDMSと硬化剤を穏やかに完全に混合します。
      注:このPDMS前駆体溶液は、後でネガ型に流し込まれ、ポジ型を形成します。
2. pH 8の0.3 Mトリエタノールアミン(TEA)緩衝液の調製
   1. 1 mL の TEA と 9 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を 50 mL のコニカル液にピペットで移動し、0.75 M TEA 溶液を調製します。1 N HClまたは1 N NaOHを使用して溶液をpH 8に滴定します。次に、最終容量が 25 mL ....

ディスカッション

ハイドロゲルベースの多細胞腫瘍スフェロイドモデルは、がん治療の発見を前進させるためにますます開発されています11,13,29。これらは、制御された方法で腫瘍微小環境の主要なパラメータをエミュレートし、その複雑さにもかかわらず、in vivoモデルよりもシンプルで安価に使用でき、多くがハイスループットスクリー.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Fisher Scientific	LC22210-4
15 mL Conicals	FALCON	352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates	Fisher Scientific	07-200-602
35 mm Petri Dish	Amazon	706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
6-well AggreWell 400	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	34421	Square pyramidal microwells
anti-adherence rinsing solution	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free	Corning	356234	Basement membrane matrix
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Thermo Scientific	62247
Detergent - Triton-X	Sigma Aldrich	T8787	Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Hemacytometer	Bright-Line	383684
Hydrophobic solution - Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)	Fisher Scientific	D1125
Leica Confocal SP8	Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 mL: 02681258
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
Parafilm	PARAFILM	PM992
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)	Amazon	mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)	Laysan Bio	SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004	Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.	Fisher Scientific	AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)	Sigma Aldrich	90279
Trypsin 0.25% (1x)	Sigma Aldrich	SH30042.01
U-87 MG human glioblastoma cells	American Type Culture Collection	HTB-14