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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e barata de esferoides tumorais seguida de encapsulamento em hidrogel. É amplamente aplicável, pois não requer equipamentos especializados. Seria particularmente útil para explorar interações matriz-esferóide e construir modelos in vitro de fisiologia ou patologia tecidual.

Resumo

O encapsulamento tridimensional (3D) de esferoides é crucial para replicar adequadamente o microambiente tumoral para um ótimo crescimento celular. Aqui, projetamos um modelo in vitro de glioblastoma 3D para encapsulamento esferoide para mimetizar o microambiente extracelular tumoral. Primeiro, formamos moldes de micropoços piramidais quadrados usando polidimetilsiloxano. Esses moldes de micropoços foram então usados para fabricar esferoides tumorais com tamanhos rigidamente controlados de 50-500 μm. Uma vez formados, os esferoides foram colhidos e encapsulados em hidrogéis à base de polietilenoglicol (PEG). Os hidrogéis de PEG são uma plataforma versátil para encapsulamento esferoide, pois as propriedades do hidrogel, como rigidez, degradabilidade e adesividade celular, podem ser ajustadas independentemente. Aqui, usamos um hidrogel macio representativo (~8 kPa) para encapsular esferoides de glioblastoma. Finalmente, um método para coloração e imagem de esferoides foi desenvolvido para obter imagens de alta qualidade via microscopia confocal. Devido ao núcleo esferoide denso e à periferia relativamente escassa, a obtenção de imagens pode ser difícil, mas o uso de uma solução de clareamento e corte óptico confocal ajuda a aliviar essas dificuldades de imagem. Em resumo, mostramos um método para fabricar esferoides uniformes, encapsula-los em hidrogéis de PEG e realizar microscopia confocal nos esferoides encapsulados para estudar o crescimento esferoide e várias interações célula-matriz.

Introdução

Os esferoides tumorais têm emergido como ferramentas úteis in vitro no estudo da etiologia, patologia e responsividade a drogasdo câncer 1. Tradicionalmente, esferoides têm sido cultivados em condições como placas de baixa adesão ou biorreatores, onde a adesão célula-célula é favorecida em relação à adesão célula-superfície2. No entanto, é hoje reconhecido que, para recapitular o microambiente tumoral com mais fidelidade, modelos esferoides in vitro devem capturar tanto as interações célula-célula quanto célula-matriz. Isso levou vários grupos a projetar arcabouços, como hidrogéis, onde esferoides podem ser encapsulados 3,4. Tais modelos esferoides baseados em hidrogel permitem a elucidação de interações célula-célula e célula-matriz sobre vários comportamentos celulares, tais como viabilidade, proliferação, tronco ou responsividade à terapia3.

Aqui, descrevemos um protocolo para encapsulação de esferoides de glioblastoma em hidrogéis de polietilenoglicol (PEG). Existem vários relatos na literatura de encapsulamento esferoide de células de glioblastoma em hidrogéis. Por exemplo, esferoides foram formados encapsulando células U87 em hidrogéis de PEG decorados com um ligante adesivo RGDS e reticulados com um peptídeo enzimaticamente clivável para determinar o efeito da rigidez do hidrogel no comportamento celular5. Células U87 também foram formadas em outros hidrogéis à base de PEG ou ácido hialurônico para expandir a população de células-tronco cancerígenas6 ou explorar mecanismos mediados pela matriz de resistência à quimioterapia 7,8,9. Esferoides de glioblastoma também têm sido encapsulados em hidrogéis de gelatina para estudar o crosstalk entre micróglia e células cancerosas e seu efeito na invasão celular10. Em geral, tais estudos têm demonstrado a utilidade de modelos in vitro baseados em hidrogel na compreensão da patologia do glioblastoma e na elaboração de tratamentos.

Além disso, existem diferentes métodos para a fabricação de esferoides tumorais e encapsulamento de hidrogel11. Por exemplo, células dispersas poderiam ser semeadas em hidrogéis e deixadas formar esferoides ao longo do tempo 5,12. Uma desvantagem de tal método é a polidispersidade dos esferoides formados, o que poderia levar a respostas celulares diferenciais. Para produzir esferoides uniformes, as células poderiam ser encapsuladas em microgéis e cultivadas por longos períodos até invadirem e remodelarem o gel13, ou as células poderiam ser depositadas em géis moldados com "furos" esféricos e deixadas agregar14. A desvantagem desses métodos é sua relativa complexidade, a necessidade de um gerador de gotículas ou outros meios para formar microgéis ou os "buracos" no gel, e o tempo que leva para os esferoides crescerem e amadurecerem. Alternativamente, os esferoides poderiam ser pré-formados em micropoços 9,15,16 ou em placas suspensas17,18 e então encapsulados em hidrogel, semelhante à técnica aqui descrita. Esses métodos são mais simples e podem ser feitos de uma forma de maior rendimento. Curiosamente, tem sido demonstrado que o método de formação de esferoides pode afetar comportamentos de células esferoides, tais como expressão gênica, proliferação celular ou responsividade a drogas19,20.

Aqui, enfocamos o glioblastoma por se tratar de um tumor sólido cujo ambiente nativo é a matriz cerebral macia e nanoporosa21, que pode ser mimetizada por um hidrogel macio e nanoporoso. O glioblastoma também é o câncer cerebral mais letal para o qual não há cura disponível22. Entretanto, o protocolo aqui descrito pode ser utilizado para o encapsulamento de esferoides representando qualquer tumor sólido. Optou-se por utilizar hidrogéis de PEG que são formados através de uma reação de adição tipo Michael23. O PEG é um hidrogel sintético, não degradável e biocompatível, inerte e serve como andaime e suporte físico celular, mas não suporta a ligação celular23. A adesividade celular pode ser adicionada separadamente via amarração de proteínas inteiras ou ligantes adesivos24, e a degradabilidade pode ser adicionada através de modificações químicas da cadeia polimérica do PEG ou reticulantes hidrolítica ou enzimaticamente degradáveis25,26. Isso permite que as propriedades bioquímicas sejam ajustadas independentemente das propriedades mecânicas ou físicas do hidrogel, o que poderia ser vantajoso no estudo das interações célula-matriz. A química de gelificação do tipo Michael é seletiva e ocorre em condições fisiológicas; Assim, permite o encapsulamento esferoide simplesmente misturando os esferoides com a solução precursora de hidrogel.

De modo geral, a metodologia aqui apresentada tem várias características notáveis. Primeiro, fabricar esferoides tumorais em uma montagem multipoço é eficiente, rápido e o custo dos materiais necessários é baixo. Em segundo lugar, os esferoides são produzidos em grandes lotes em uma variedade de tamanhos com baixa polidispersidade. Finalmente, apenas materiais disponíveis comercialmente são necessários. A utilidade da metodologia é ilustrada pela exploração do efeito das propriedades do substrato na viabilidade das células esferoides, circularidade e tronco celular.

Protocolo

1. Preparação das soluções

  1. Preparação de solução precursora de polidimetilsiloxano (PDMS)
    1. Preparar a solução precursora negativa de PDMS (também usada para a solução de precursor de cola). Coloque o elastômero em um barco de pesagem usando uma espátula e pese-o. Adicione o agente de cura à base do elastômero na proporção de 1:10. Misture o PDMS e o agente de cura suave e cuidadosamente usando a espátula no barco de pesagem de plástico.
      NOTA: Esta solução precursora de PDMS é despejada na placa de micropoço piramidal quadrada de 6 poços para formar o molde negativo. Esta é a mesma solução que é usada para a solução precursora de cola.
    2. Prepare a solução precursora positiva do PDMS. Coloque a base de elastômero no barco de pesagem usando uma espátula e pese-a. Adicione o agente de cura à base do elastômero na proporção de 1:9. Misture o PDMS e o agente de cura suave e cuidadosamente usando a espátula no barco de pesagem de plástico.
      NOTA: Esta solução precursora de PDMS é posteriormente despejada no molde negativo para formar o molde positivo.
  2. Preparação de tampão 0,3 M de trietanolamina (TEA) pH 8
    1. Pipetar 1 mL de TEA e 9 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x para um cônico de 50 mL usando um auxílio de pipeta para criar uma solução de TEA 0,75 M. Titular a solução até um pH de 8 utilizando 1 N HCl ou 1 N NaOH. Em seguida, adicione 1x PBS suficiente para atingir um volume final de 25 mL para atingir uma concentração final de TEA de 0,3 M com um pH de 8.
      CUIDADO: Armazene as soluções de HCl e NaOH em um armário inflamável à temperatura ambiente (TR). Use equipamentos de proteção individual ao manusear.
  3. Preparação de mídias completas
    1. Para o preparo do meio completo, adicionar 10% (p/v) ou 56 mL de soro fetal bovino e 1% (p/v) ou 5,6 mL de penicilina e estreptomicina a 500 mL de RPMI em meio RPMI.
    2. Colocar a solução a 37 °C durante 10-20 minutos ou até que a solução esteja quente antes de utilizar.
    3. Conservar a solução a 0-4 °C até 6 meses.
  4. Preparação de soluções-estoque de polietilenoglicol (PEG) a 20% (p/v)
    NOTA: O cálculo baseia-se em soluções de 100 μL que podem ser aumentadas ou reduzidas conforme necessário.
    1. Para preparar uma solução-mãe de 100 μL de 20% p/v de 4 braços de PEG-Acrilato (4 braços PEG-Ac), pesar 20 mg de pó de PEG-Ac de 4 braços em um tubo de microfuga. Adicionar 70 μL de tampão TEA 0,3 M e, em seguida, agitar a solução por cerca de 30 s ou até dissolver completamente. Considere a mudança de volume devido à dissolução do pó adicionando tampão TEA suficiente (~27 μL) para atingir um volume final de solução de 100 μL.
    2. Para preparar uma solução-mãe de 100 μL de 20% p/v PEG-diSH, pesar 20 mg de pó de PEG-diSH em um tubo de microfuga. Adicione 70 μL de tampão TEA e, em seguida, agite a solução por cerca de 30 s ou até dissolver completamente. Considere a mudança de volume devido à dissolução do pó adicionando tampão TEA suficiente (~27 μL) para atingir um volume final de solução de 100 μL.
      NOTA: O pó de PEG é muito higroscópico e precisa ser armazenado em um recipiente dessecado a -20 °C. Ao retirá-lo do congelador, deixe o pó de PEG descongelar por 10 minutos antes de abrir o frasco para pesar o pó. Limpe a garrafa com um gás inerte, como nitrogênio ou argônio, para deslocar o ar úmido antes de devolvê-lo ao congelador. A solução-mãe de PEG-Ac de 4 braços pode ser armazenada a 4 °C por até 2 semanas antes do uso. A solução-estoque de PEG-diSH precisa ser preparada imediatamente antes do uso e não pode ser armazenada porque os grupos tióis reagem entre si para formar ligações dissulfeto.
  5. Preparação de solução de matriz de membrana basal a 2% v/v
    1. Para preparar uma solução de trabalho de matriz de membrana basal a 2% v/v, adicione 20 μL da matriz de membrana basal (livre de LDEV) a 9,98 mL de meio completo e misture completamente pipetando para cima e para baixo ~10 vezes. Preparar a solução a 4 °C (no gelo), depois aquecê-la a 37 °C (num forno ou incubadora) e utilizar imediatamente.
      NOTA: A matriz da membrana basal começará a formar um gel a >10 °C, portanto, certifique-se de misturar a solução da matriz da membrana basal com o meio completo a 2-6 °C. A composição completa dos meios é descrita na etapa 1.3.
  6. Preparação da solução fixadora celular
    1. Para preparar 1 mL de solução fixadora celular contendo 4% p/v de paraformaldeído e 0,1% v/v de surfactante não iônico, primeiro misturar 891 μL de 1x PBS e 108 μL de paraformaldeído (concentração de 37% p/v) e, em seguida, adicionar 1 μL de tensoativo não iônico (concentração de 100%). Misture bem a solução.
      NOTA: A solução fixadora deve ser renovada sempre que a fixação for realizada.
      CUIDADO: O paraformaldeído é inflamável e pode formar concentrações de poeira combustível no ar. Causa irritação da pele e danos oculares graves. Evite respirar, pois pode causar irritação respiratória. Manuseie o paraformaldeído em um exaustor químico e use equipamentos de proteção individual. Lave bem as mãos após o manuseio. O surfactante não iônico causa irritação da pele e danos oculares graves. Use luvas de proteção e proteção ocular ou facial ao manusear. Para evitar a liberação no meio ambiente, abra a garrafa em uma coifa de fumaça química. Lave bem as mãos após o manuseio.
  7. Preparo das soluções corantes
    1. Para preparar 3 mM de iodeto de 3,3'-dihexiloxacarbocianina (DiOC), misturar 2,65 mg de DiOC em 1 mL de DMSO.
    2. Para preparar 1,5 mM de solução de iodeto de propídio (PI), misturar 1 mg de IP em 1 mL de água desionizada.
  8. Preparação da solução de depuração esferoide
    1. Preparar soluções de limpeza de 20%, 40% e 80% v/v de formamida em 1x PBS para limpeza esferoide.
      1. Para fazer 10 mL de formamida 20% v/v, misturar 8 mL de 1x PBS seguido de 2 mL de formamida. Para fazer 10 mL de formamida 40% v/v, misturar 6 mL de 1x PBS seguido de 4 mL de formamida. Para fazer 10 mL de formamida a 80% v/v, misturar 2 mL de 1x PBS seguido de 8 mL de formamida.
      2. Depois de combinar formamida e 1x PBS, misture a solução por vórtice por cerca de 30 s.

2. Fabricação de micropoços piramidais quadrados

  1. Fabricar molde PDMS negativo de micropoços piramidais quadrados como mostrado na Figura 1.
    1. Prepare 2 g (~1 mL) de solução precursora de PDMS negativa e despeje-a em um poço de um molde mestre piramidal quadrado de 6 poços. Observe que 1 mL cobre completamente um poço da placa. Depois de cobrir o molde mestre com PDMS, desgaseifique a solução precursora de PDMS por 30 minutos colocando a placa piramidal quadrada de 6 poços em um dessecador a vácuo. Em seguida, cure o PDMS colocando a placa em um forno de 60 °C por 24 h.
      NOTA: Certifique-se de que a tampa da placa é removida para desgaseificação e colocada novamente para cura. Desgaseifique a solução em um exsicador a vácuo ou através de purga com um gás inerte, como nitrogênio ou argônio. Se a solução precursora do molde negativo ainda apresentar bolhas após 30 min, indicando desgaseificação inadequada, coloque-a em um exsicador a vácuo por mais 30 min. Use um ou vários poços de placa simultaneamente para preparar um ou mais moldes negativos de PDMS. Micropoços piramidais quadrados de diferentes tamanhos podem ser usados, como comprimentos laterais de 400 e 800 μm, como mostra a Tabela 1. A mesma quantidade de PDMS é usada independentemente dos tamanhos piramidais quadrados.
    2. Uma vez que o PDMS cura ainda quente, remova cuidadosamente o molde PDMS negativo do molde mestre usando uma espátula e corte o molde negativo em uma laje de 35 mm de diâmetro usando um punch de biópsia. Coloque em uma placa de Petri e cubra com a tampa e deixe a cura contínua por mais 24 h.
      NOTA: Para remover os moldes negativos, use uma espátula para ficar entre a placa do poço e o molde PDMS e puxe suavemente o molde negativo do molde mestre. O molde é cortado em placas de 35 mm para encaixar uma placa de Petri de 35 mm. Os moldes podem ser feitos em outros tamanhos para encaixar chapas de diferentes diâmetros. As placas negativas de molde de 35 mm podem ser armazenadas, protegidas da poeira em RT e reutilizadas por 6 meses.
  2. Preparar molde PDMS positivo de micropoços piramidais quadrados.
    1. Coloque as placas de 35 mm do molde negativo do PDMS em uma placa de Petri de 35 mm com os micropoços texturizados voltados para cima.
    2. Prepare 2,5 g (~1,2 mL) de solução precursora de PDMS positiva como acima e despeje-a sobre o molde negativo na placa de Petri de 35 mm para cobrir completamente o molde negativo. Em seguida, desgaseifique a solução precursora por 30 min como acima e coloque-a em forno a 60 °C por 3-4 h.
      NOTA: Como o PDMS é viscoso, uma bolha pode se formar a partir do ar preso sob o molde negativo. Se uma bolha se formar sob o molde negativo, empurre o molde suavemente para baixo usando uma espátula para liberar a bolha. Se as bolhas de ar permanecerem, continue desgaseificador por 30 min, ou pegue uma espátula e mexa suavemente a solução do molde positivo até que as bolhas estourem.
    3. Uma vez curado o molde PDMS positivo, remova os moldes da placa de Petri de 35 mm e descasque imediatamente o molde positivo do molde negativo.
      NOTA: O tempo é importante para o sucesso do descascamento do molde positivo. A remoção é melhor feita cortando ligeiramente o molde positivo usando uma navalha para expor a interface entre o molde positivo e negativo e descascando os moldes uns dos outros. Em seguida, descasque as bordas do molde circular. Descasque suavemente o molde negativo do molde positivo.
  3. Cole os moldes no fundo dos poços de uma placa de 48 poços.
    NOTA: Aqui, uma placa de 48 poços é usada, mas outras placas podem ser usadas desde que as placas do molde sejam cortadas nos diâmetros corretos (por exemplo, 6 mm de diâmetro para uma placa de 96 poços).
    1. Corte os moldes positivos em placas usando um punch de biópsia de 10 mm.
      NOTA: Aproximadamente 4 moldes (cada um com 10 mm de diâmetro) podem ser cortados a partir de um molde positivo de 35 mm de diâmetro.
    2. Para colar os moldes no fundo de uma placa de 48 poços, prepare a solução precursora de cola PDMS (~0,5 mL ou 1 g), conforme descrito anteriormente27. Use uma pinça para mergulhar suavemente o lado plano (não o lado com o padrão de micropoços) do molde positivo de 10 mm na solução precursora do PDMS. Coloque cuidadosamente um molde por poço de uma placa de 48 poços e pressione suavemente cada molde no fundo do poço usando o tweezer. Coloque a placa montada em um forno de 60 °C por 4-24 h para permitir que a cola PDMS cure.
      NOTA: Se a solução precursora de cola PDMS entrar nos micropoços de molde positivos, ela pode ser limpa usando papel de tecido macio e a etapa pode ser repetida. Ao colar, certifique-se de que a cola não cubra os micropoços.
    3. Esterilizar moldes adicionando 300 μL de etanol 70% em cada poço da placa de 48 poços usando uma pipeta de 1000 μL. Aspirar o etanol a 70% e colocar a placa de 48 poços descoberta em uma capela de cultura de tecidos sob UV (302 nm) por 2 h.
      NOTA: Os moldes podem ser usados por 6 meses e re-esterilizados conforme a necessidade.

3. Formação, colheita e encapsulamento de esferoides tumorais multicelulares em hidrogéis

NOTA: O protocolo descrito nesta seção é para a linhagem celular de glioblastoma humano U87 (ver Figura 1 e Figura 2), mas um protocolo semelhante poderia ser usado com outros tipos de células cancerosas.

  1. Formação esferoide tumoral multicelular
    1. Lave primeiro os moldes de micropoços com uma solução de enxágue antiaderente, adicionando 300 μL da solução a cada poço usando uma pipeta de 1000 μL. Em seguida, centrifugar a 1620 x g por 3 min e aspirar a solução usando uma bomba de vácuo e uma pipeta de Pasteur.
      Observação : execute esta etapa imediatamente antes da propagação de célula.
    2. Expor as células a ~80 μL de tripsina/EDTA a 0,25% por cada cm2 da área do frasco de cultura durante 5 min a 37 °C. Por exemplo, 1 mL de tripsina/EDTA é apropriado para um frasco de cultura de células T-25. Neutralizar a tripsina adicionando o mesmo volume de meio de cultura celular completo. Por exemplo, adicionar 1 mL de meio completo ao balão de cultura de células T-25 contendo tripsina. Recolher as células do balão de cultura de tecidos.
    3. Transferir 10 μL da suspensão celular para cada porta de um hemocitômetro para contagem celular. Use um microscópio invertido para contar o número total de células e fazer a média dessa contagem de células a partir de pelo menos 8 quadrantes, garantindo que o número de células em cada quadrante do hemocitômetro seja de 20-50 para bons resultados de contagem de células. Multiplique o número calculado por 104 para determinar a concentração celular final.
    4. Ressuspender as células coletadas em meio de cultura de células RPMI completo suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina na concentração final desejada das células, dependendo do tamanho esferoide desejado, como mostra a Tabela 1.
      NOTA: Os micropoços de 800 μm produzirão ~75 esferoides em um poço de uma placa de 48 poços, e os micropoços de 400 μm produzirão ~300 esferoides em um poço de uma placa de 48 poços.
    5. Colocar 500 μL de suspensão celular na concentração desejada em micropoços e centrifugar a placa a 1620 x g por 3 min. Colocar a placa numa incubadora humidificada a 37 °C e 5% CO2 durante 24 h para permitir a formação de esferoides.
      NOTA: Se os esferoides não se formarem, 2% v/v da matriz da membrana basal combinada com meios completos pode ser usada para ressuspender as células (mais detalhes na etapa 1.5).
  2. Colheita de esferoides
    1. Usando uma pipeta de 1000 μL, pipete firmemente 500 μL de meio completo para o poço. Usando 500 μL de meio do poço, lave os quatro quadrantes do poço (especificamente os quadrantes superior, inferior, esquerdo e direito) pipetando para cima e para baixo nos quadrantes três a quatro vezes para desalojar os esferoides. Aspirar suavemente o meio que contém os esferoides (~1000 μL no total) para um tubo de microcentrífuga usando uma pipeta de 1000 μL e deixar que os esferoides se depositem no fundo.
    2. Retire o sobrenadante e ressuspenda os esferoides até a concentração final desejada. Por exemplo, para obter ~8 esferoides em um gel de 20 μL após o encapsulamento, ressuspenda os esferoides em 100 μL de meio, produzindo uma concentração esferoide de ~75 esferoides/100 μL na suspensão esferoide.
  3. Encapsulamento de esferoides em hidrogéis, como mostra a Figura 2.
    1. Para criar 100 μL de uma solução precursora de hidrogel de PEG a 10% p/v, combine 50 μL da suspensão esferoide, seguido por 30 μL de PEG-Ac de 4 braços a 20% p/v e, finalmente, 20 μL de 20% p/v PEG-diSH em um tubo de microcentrífuga. Isso dará uma razão molar estequiométrica dos grupos acrilato (Ac) para tiol (SH), garantindo uma ótima reticulação. Misture a solução precursora de gel pipetando para cima e para baixo ~10 vezes.
      NOTA: A composição, o volume e a concertação do polímero do hidrogel podem ser alterados conforme necessário. Os hidrogéis resultantes serão lentamente degradantes e adesivos não celulares. Para fazer a célula de hidrogel adesiva, um ligante adesivo como RGDS pode ser adicionado. Para tornar o hidrogel enzimaticamente degradável, um reticulante peptídico enzimaticamente degradável contendo resíduos de cisteína em ambas as extremidades poderia ser adicionado. Ao transferir esferoides, pipetar suavemente a solução duas vezes para desalojar os esferoides e colocá-los em suspensão para garantir uma distribuição uniforme dos esferoides.
    2. Pipetar 20 μL da solução precursora de gel entre duas lâminas de vidro revestidas de parafilme separadas com espaçadores de silicone de 1 mm e colocar as lâminas com solução precursora de gel em incubadora a 37 °C, CO2 a 5% durante 15 minutos para permitir a gelificação.
      NOTA: Certifique-se de que as duas lâminas de vidro estejam cobertas de parafilme para criar uma superfície hidrofóbica que permita um descamação fácil após a gelificação. Em vez de parafilme, uma solução de revestimento hidrofóbico pode ser usada. Um volume de 20 μL de solução precursora de hidrogel resultará em uma placa de hidrogel de ~6 mm de diâmetro e 1 mm de altura antes do inchaço. Qualquer tipo e espessura de espaçador pode ser usado, mas recomenda-se que a espessura do gel seja mantida em ou abaixo de 1 mm (hidrogéis mais espessos podem limitar a difusão de oxigênio e o transporte de nutrientes para as células), mas maior do que o diâmetro esferoide (para que os esferoides sejam completamente encapsulados no gel). Qualquer volume da solução precursora de hidrogel pode ser usado. Os géis de 20-30 μL são adequados para uma placa de 24 poços.
    3. Quando a gelificação do hidrogel estiver completa, separe as duas lâminas de vidro e descasque suavemente os géis da placa de vidro usando uma espátula. Coloque os géis em uma placa de 24 poços, um por poço, garantindo que a superfície que contém os esferoides fique voltada para cima.
      NOTA: Os esferoides cairão no fundo do gel durante a gelificação, portanto, invertê-los para cultivo garantirá que os esferoides estejam perto da superfície do hidrogel para melhor acesso a nutrientes e oxigênio. A gelificação pode ser monitorada observando qualquer solução precursora de hidrogel remanescente no tubo de microcentrífuga e não usada para criar lajes, invertendo o tubo e observando o tempo em que o gel para de fluir.
    4. Adicione meio completo (~500 μL) a cada poço e certifique-se de que o hidrogel está completamente submerso. Colocar a placa multipoço em estufa umidificada a 37 °C e 5% CO2 e cultivar as células com trocas de meio a cada 2-3 dias.
      OBS: Os hidrogéis podem ser cultivados por até 4 semanas ou até que os hidrogéis se degradem, trocando o meio a cada dois dias.

4. Coloração fluorescente

  1. Viabilidade celular
    1. Utilizar a coloração iodeto de 3,3'-dihexiloxacarbocianina (DiOC), que cora a mitocôndria e o retículo endoplasmático de todas as células, para determinar a viabilidade celular. Utilizar DiOC (3 mM) na concentração de 0,02 μg/mL. Especificamente, utilizar uma pipeta de 20 μL para adicionar 2 μL de DiOC por cada 1000 μL de meio no balão de cultura das células dissociadas (pelo menos 24 h antes do processo de formação dos esferoides na secção 3). Aguarde 24 h para que o DiOC core as células.
    2. Utilizar a coloração nuclear e cromossômica, iodeto de propídio, PI (1,50 mM), que entra apenas em células mortas. Para manchar as células, primeiro aspirar todos os meios e enxaguar o gel usando uma pipeta de 1000 μL para adicionar 500 μL de 1x PBS para que o gel fique completamente submerso.
    3. Aspirar o PBS e adicionar 500 μL de meio fresco, seguido de 30 μL da solução de IP em cada poço (ou seja, 6 μL por cada 100 μL de meio). Cubra a placa do poço com papel alumínio para protegê-la da luz. Coloque a placa do poço em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2 e aguarde 30 minutos para que o IP core as células mortas.
    4. Retire a folha e aspirar o meio dos poços. Use uma pipeta de 1000 μL para adicionar 500 μL de 1x PBS para submergir o hidrogel. Aspirar o PBS 1x e repetir o enxágue mais duas vezes. Adicionar 500 μL de meio a cada poço e obter imagens em microscópio fluorescente invertido ou confocal.
    5. Calcular a viabilidade celular comparando a área de DiOC (todas as células) com PI (células mortas), conforme representado na equação 1, usando imagens z-stack de um microscópio confocal ou de um microscópio fluorescente invertido.
      figure-protocol-20506 Eq. 1º.

5. Fixação, coloração, clareamento e imagem por imunofluorescência de esferoides encapsulados

  1. Fixação e coloração
    1. Aspirar o meio dos poços onde os hidrogéis são cultivados e enxaguar os hidrogéis pipetando 500 μL de 1x PBS diretamente sobre os hidrogéis. Aspirar suavemente o PBS 1x.
    2. Fixar os esferoides na placa de 24 poços usando uma pipeta de 1000 μL para adicionar 500 μL de volume de solução fixadora por poço. Deixe o fixador de molho por 30 min no RT. Retire a solução fixadora usando uma pipeta de 1000 μL e descarte em um recipiente de resíduos designado.
    3. Enxágue os hidrogéis adicionando 500 μL de 1x PBS a cada poço. Aspirar o PBS 1x usando uma pipeta de 1000 μL e repetir o enxágue PBS duas vezes adicionais. Conservar a placa do poço em 500 μL de 1x PBS por poço a 4 °C durante até 1 semana ou utilizar imediatamente.
      NOTA: Tenha cuidado para não puxar os hidrogéis para dentro da pipeta ao aspirar PBS e solução fixadora. Faça isso inclinando a placa para um ângulo de ~45 graus, o que ajudará a ver os hidrogéis e evitar a aspiração acidental.
      CUIDADO: O formaldeído é tóxico por inalação e contato. Manuseie com luvas em um exaustor de fumaça química.
    4. Para corar as células, incubar os esferoides encapsulados em hidrogel com anticorpos primários para Nestin (200 μg/mL) e SOX2 (200 μg/mL) em uma diluição de 1:200 de anticorpo: PBS. Use uma pipeta de 1000 μL para aspirar o PBS 1x dos poços. Adicionar 50 μL do anticorpo diluído a cada poço. Aguarde 24 h para que a coloração seja completada. Em seguida, remova a solução corante usando uma pipeta de 1000 μL e descarte os resíduos adequadamente.
    5. Use uma pipeta de 1000 μL para adicionar 500 μL de 1xPBS, o que é suficiente para submergir o hidrogel. Aspirar a EEP e repeti-la mais duas vezes. Armazenar o hidrogel corado e submerso em 1x PBS a 4 °C por até 2 semanas antes da aquisição de imagens ou imagens imediatamente.
      NOTA: Pequenas otimizações podem ser necessárias dependendo do anticorpo para garantir a coloração adequada. A concentração (1:200) e o tempo (24 h) são significativamente maiores do que na cultura de células monocamada 2D típica, pois a coloração 3D requer difusão através do hidrogel e dos esferoides.
  2. Depois de colorir os esferoides, limpe o esferoide para melhorar a transparência da imagem, substituindo o PBS por um aumento sequencial da concentração de formamida (opcional).
    1. Aspirar o PBS 1x de cada poço. Adicionar 500 μL de formamida a 20% (v/v) em cada poço e deixar o hidrogel incubar por 90 min. Aspirar a formamida utilizando uma pipeta de 1000 μL e recolher os resíduos num recipiente de resíduos.
    2. Adicionar 500 μL de formamida a 40% (v/v) ao poço. Deixe o hidrogel incubar na solução durante 90 minutos. Aspirar a formamida e recolher os resíduos no contentor de resíduos.
    3. Adicionar 500 μL de formamida 80% v/v a cada poço e incubar por 90 min. Aspirar a formamida e descartar no recipiente de resíduos. Adicionar 500 μL de 100% (v/v) de formamida e permitir 24 h de incubação antes da aquisição de imagens. Quando a limpeza estiver concluída, descarte corretamente os resíduos de formamida através dos serviços apropriados de um sistema de gerenciamento de resíduos de laboratório.
      NOTA: A limpeza permite imagens confocais no núcleo do esferoide e é opcional se apenas a periferia do esferoide estiver sendo investigada.
  3. Imagem de esferoides encapsulados em hidrogel usando microscopia confocal.
    NOTA: Qualquer microscópio - invertido, fluorescente ou confocal - pode ser usado para imagens celulares; no entanto, o confocal permite o isolamento de planos únicos.
    1. Coloque os hidrogéis em poços com câmaras com fundos de vidro e posicione os esferoides o mais próximo possível da lamínula.
      NOTA: Podem ser utilizadas lamínulas de vidro ou poços com tampas de vidro. É crucial manter os hidrogéis hidratados, pois amostras desidratadas resultarão em baixa qualidade de imagem.
    2. Fotografe as amostras com uma objetiva de longa distância de trabalho (10x-20x) para permitir imagens profundas no esferoide usando pilhas Z para reconstruções 3D.
      NOTA: Objetivos de ampliação mais altos permitem imagens mais detalhadas e seccionamento óptico, mas sacrificam a profundidade da imagem.
    3. Quantifique a quantidade de sinal presente na seção óptica em relação à área total do esferoide para o sinal limpo e não limpo usando a equação 2.
      figure-protocol-25185 Eq. 2

Resultados

Plataformas de triagem de fármacos baseadas em esferoides para estudar os efeitos quimioterápicos são cada vez mais procuradas devido à ênfase na modulação do microambiente tumoral sobre o encapsulamento esferoide em biomateriais replicantes de tecido nativo. Aqui desenvolvemos um método para preparação de esferoides tumorais multicelulares e posterior encapsulamento e imageamento em hidrogel 3D. Os esferoides são preparados em moldes de micropoços (Figura 3A,B), que resultam em ...

Discussão

Modelos esferoides tumorais multicelulares baseados em hidrogel estão sendo cada vez mais desenvolvidos para avançar nas descobertas terapêuticas do câncer11,13,29. Eles são benéficos porque emulam parâmetros-chave do microambiente tumoral de forma controlada e, apesar de sua complexidade, são mais simples e baratos de usar do que os modelos in vivo, e muitos são compatíveis com tecnologias de rastreamento de alto rend...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por fundos iniciais fornecidos à Dra. Silviya P Zustiak pela Saint Louis University, bem como por uma bolsa semente do Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience da Saint Louis University concedida à Dra. Silviya P Zustiak.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
70% EthanolFisher Scientific LC22210-4
15 mL ConicalsFALCON352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment platesFisher Scientific07-200-602
35 mm Petri DishAmazon706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL ConicalsFisher Scinetific3181345107
6-well AggreWell 400 StemCell Technologies, Vancouver, Canada34421Square pyramidal microwells 
anti-adherence rinsing solutionStemCell Technologies, Vancouver, CanadaCat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptideGenic Bio, Shanghai, Chinan/aCustom synthesis
Chemical Fume HoodKEWAUNEE99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free Corning356234Basement membrane matrix
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)Thermo Scientific62247
Detergent - Triton-XSigma AldrichT8787Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Fisher Scinetific1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30073-03
Formaldehyde 37% SolutionSigma AldrichF1635
Glass PlatesSlumpysGBS4100SFSL
Glass Transfer PipettesFisher Scinetific5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptideGenic Bio, Shanghai, Chinan/aCustom synthesis
HemacytometerBright-Line383684
Hydrophobic solution - Repel Silane GE Healthcare Bio-Sciences17-1332-01
IncubatorNUAIRENU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)Zeiss663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)Fisher Scientific D1125
Leica Confocal SP8Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)Zeiss3820005619
Micro centrifuge tubesFisher Scientific2 mL: 02681258
Microscope SoftwareZeissAxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594 Santa Cruz Biotechnologysc-23927
ParafilmPARAFILM PM992
PBS (1x), pH 7.4HyCloneSH30256.01
Penicillin StreptomycinMP Biomedicals1670046
Pipette AidDrummond Scientific Co.P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)Fisher Scinetific2707509
Plastic Standard Disposable Transfer PipettesFisher Scientific13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)Amazon mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)Laysan BioSH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]Elsworth Adhesives3097358-1004Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination GlovesQuest92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln. Fisher Scientific AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)HyCloneSH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cmGrace Bio-LabsJTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnologysc-365823
Tissue Culture HoodNUAIRENU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC) Sigma Aldrich90279
Trypsin 0.25% (1x) Sigma AldrichSH30042.01
U-87 MG human glioblastoma cellsAmerican Type Culture Collection HTB-14

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