Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que permite la fabricación rápida, robusta y barata de esferoides tumorales seguida de encapsulación de hidrogel. Es ampliamente aplicable ya que no requiere equipo especializado. Sería particularmente útil para explorar las interacciones esferoides-matrices y construir modelos de fisiología tisular o patología in vitro .

Resumen

La encapsulación tridimensional (3D) de esferoides es crucial para replicar adecuadamente el microambiente tumoral para un crecimiento celular óptimo. Aquí, diseñamos un modelo de glioblastoma 3D in vitro para la encapsulación de esferoides para imitar el microambiente extracelular del tumor. Primero, formamos moldes de micropocillos piramidales cuadrados utilizando polidimetilsiloxano. Estos moldes de micropocillos se utilizaron para fabricar esferoides tumorales con tamaños estrictamente controlados de 50 a 500 μm. Una vez formados los esferoides, se cosecharon y encapsularon en hidrogeles a base de polietilenglicol (PEG). Los hidrogeles PEG son una plataforma versátil para la encapsulación de esferoides, ya que las propiedades del hidrogel, como la rigidez, la degradabilidad y la adhesividad celular, se pueden ajustar de forma independiente. En este caso, utilizamos un hidrogel blando representativo (~8 kPa) para encapsular los esferoides de glioblastoma. Por último, se desarrolló un método para teñir e obtener imágenes de esferoides para obtener imágenes de alta calidad mediante microscopía confocal. Debido al núcleo esferoide denso y a la periferia relativamente escasa, la obtención de imágenes puede ser difícil, pero el uso de una solución de limpieza y el corte óptico confocal ayuda a aliviar estas dificultades de obtención de imágenes. En resumen, mostramos un método para fabricar esferoides uniformes, encapsularlos en hidrogeles PEG y realizar microscopía confocal sobre los esferoides encapsulados para estudiar el crecimiento de esferoides y diversas interacciones célula-matriz.

Introducción

Los esferoides tumorales han surgido como herramientas útiles in vitro en el estudio de la etiología, la patología y la respuesta a los fármacos^{del cáncer 1}. Tradicionalmente, los esferoides se han cultivado en condiciones tales como placas de baja adherencia o biorreactores, donde la adhesión célula-célula se ve favorecida sobre la adhesión célula-superficie². Sin embargo, ahora se reconoce que para recapitular el microambiente tumoral de manera más fiel, los modelos esferoides in vitro deben capturar tanto las interacciones célula-célula como las célula-matriz. Esto ha llevado a múltiples grupos a dis....

Protocolo

1. Preparación de soluciones

1. Preparación de una solución precursora de polidimetilsiloxano (PDMS)
   1. Prepare la solución precursora negativa de PDMS (también utilizada para la solución precursora de pegamento). Coloque el elastómero en un bote de pesaje con una espátula y péselo. Agregue el agente de curado a la base de elastómero en una proporción de 1:10. Mezcle el PDMS y el agente de curado suave y minuciosamente con la espátula en el bote de pesaje de plástico.
      NOTA: Esta solución precursora de PDMS se vierte en la placa piramidal cuadrada de micropocillos de 6 pocillos para formar el molde negativo. Esta es la misma solución que ....

Discusión

Los modelos de esferoides tumorales multicelulares basados en hidrogel se están desarrollando cada vez más para avanzar en los descubrimientos terapéuticos del cáncer 11,13,29. Son beneficiosos porque emulan parámetros clave del microambiente tumoral de forma controlada y, a pesar de su complejidad, son más sencillos y baratos de usar que los modelos in vivo, y muchos son compatibles con las tecnologías de cribado de alto.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Fisher Scientific	LC22210-4
15 mL Conicals	FALCON	352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates	Fisher Scientific	07-200-602
35 mm Petri Dish	Amazon	706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
6-well AggreWell 400	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	34421	Square pyramidal microwells
anti-adherence rinsing solution	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free	Corning	356234	Basement membrane matrix
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Thermo Scientific	62247
Detergent - Triton-X	Sigma Aldrich	T8787	Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Hemacytometer	Bright-Line	383684
Hydrophobic solution - Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)	Fisher Scientific	D1125
Leica Confocal SP8	Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 mL: 02681258
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
Parafilm	PARAFILM	PM992
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)	Amazon	mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)	Laysan Bio	SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004	Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.	Fisher Scientific	AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)	Sigma Aldrich	90279
Trypsin 0.25% (1x)	Sigma Aldrich	SH30042.01
U-87 MG human glioblastoma cells	American Type Culture Collection	HTB-14