Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in Polyethylenglykol-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine schnelle, robuste und kostengünstige Herstellung von Tumorsphäroiden mit anschließender Hydrogelverkapselung ermöglicht. Es ist weit verbreitet, da es keine spezielle Ausrüstung erfordert. Es wäre besonders nützlich für die Erforschung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen und die Erstellung von In-vitro-Gewebephysiologie - oder Pathologiemodellen.

Zusammenfassung

Die dreidimensionale (3D) Verkapselung von Sphäroiden ist entscheidend, um die Tumormikroumgebung für ein optimales Zellwachstum angemessen zu replizieren. Hier haben wir ein In-vitro-3D-Glioblastommodell für die Sphäroidverkapselung entwickelt, um die extrazelluläre Mikroumgebung des Tumors nachzuahmen. Zuerst bildeten wir quadratische pyramidale Mikrotiterformen mit Polydimethylsiloxan. Diese Mikrotiterformen wurden dann zur Herstellung von Tumorsphäroiden mit streng kontrollierten Größen von 50-500 μm verwendet. Sobald sich Sphäroide gebildet hatten, wurden sie geerntet und in Hydrogele auf Polyethylenglykol (PEG)-Basis eingekapselt. PEG-Hydrogele sind eine vielseitige Plattform für die Sphäroidverkapselung, da Hydrogeleigenschaften wie Steifigkeit, Abbaubarkeit und Zelladhäsion unabhängig voneinander eingestellt werden können. Hier verwendeten wir ein repräsentatives weiches (~8 kPa) Hydrogel, um Glioblastom-Sphäroide einzukapseln. Schließlich wurde eine Methode zum Färben und Abbilden von Sphäroiden entwickelt, um mittels konfokaler Mikroskopie qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten. Aufgrund des dichten Sphäroidkerns und der relativ spärlichen Peripherie kann die Bildgebung schwierig sein, aber die Verwendung einer Clearing-Lösung und konfokaler optischer Schnitte hilft, diese Bildgebungsschwierigkeiten zu lindern. Zusammenfassend zeigen wir eine Methode zur Herstellung einheitlicher Sphäroide, zur Verkapselung in PEG-Hydrogele und zur Durchführung einer konfokalen Mikroskopie an den verkapselten Sphäroiden, um das Sphäroidwachstum und verschiedene Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu untersuchen.

Einleitung

Tumorsphäroide haben sich als nützliche In-vitro-Werkzeuge bei der Untersuchung der Ätiologie, Pathologie und des Ansprechens auf Medikamente bei Krebs^{erwiesen 1}. Traditionell wurden Sphäroide unter Bedingungen wie Platten mit geringer Adhäsion oder Bioreaktoren kultiviert, bei denen die Zell-Zell-Adhäsion gegenüber der Zell-Oberflächen-Adhäsion bevorzugt wird². Es ist jedoch inzwischen anerkannt, dass In-vitro-Sphäroidmodelle sowohl Zell-Zell- als auch Zell-Matrix-Interaktionen erfassen sollten, um die Tumormikroumgebung originalgetreuer zu rekapitulieren. Dies hat mehrere Gruppen dazu veranlasst, Ger....

Protokoll

1. Vorbereitung der Lösungen

1. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Vorläuferlösung
   1. Bereiten Sie die negative PDMS-Vorläuferlösung vor (wird auch für die Leimvorläuferlösung verwendet). Schöpfen Sie das Elastomer mit einem Spatel in ein Wägeschiffchen und wiegen Sie es. Geben Sie das Härter im Verhältnis 1:10 auf die Elastomerbasis. Mischen Sie PDMS und Härter vorsichtig und gründlich mit dem Spatel in der Kunststoffwaage.
      HINWEIS: Diese PDMS-Vorläuferlösung wird in die quadratische pyramidale 6-Well-Mikrotiterplatte gegossen, um die Negativform zu bilden. Dies ist die gleiche Lösung, die für die Leimvorläuferlösung verwendet w....

Diskussion

Hydrogel-basierte multizelluläre Tumor-Sphäroidmodelle werden zunehmend entwickelt, um die Entdeckungen der Krebstherapie voranzutreiben 11,13,29. Sie sind vorteilhaft, weil sie Schlüsselparameter der Tumormikroumgebung auf kontrollierte Weise emulieren und trotz ihrer Komplexität einfacher und kostengünstiger zu verwenden sind als In-vivo-Modelle, und viele sind mit Hochdurchsatz-Screening-Technologien kompatibel. Die Hydr.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Fisher Scientific	LC22210-4
15 mL Conicals	FALCON	352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates	Fisher Scientific	07-200-602
35 mm Petri Dish	Amazon	706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
6-well AggreWell 400	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	34421	Square pyramidal microwells
anti-adherence rinsing solution	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free	Corning	356234	Basement membrane matrix
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Thermo Scientific	62247
Detergent - Triton-X	Sigma Aldrich	T8787	Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Hemacytometer	Bright-Line	383684
Hydrophobic solution - Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)	Fisher Scientific	D1125
Leica Confocal SP8	Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 mL: 02681258
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
Parafilm	PARAFILM	PM992
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)	Amazon	mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)	Laysan Bio	SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004	Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.	Fisher Scientific	AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)	Sigma Aldrich	90279
Trypsin 0.25% (1x)	Sigma Aldrich	SH30042.01
U-87 MG human glioblastoma cells	American Type Culture Collection	HTB-14