نهج التصوير داخل الجسم المبسط للمراقبة طويلة المدى لديناميكيات الأنسجة الظهارية على مجهر متحد البؤر مقلوب

Summary

يقدم البروتوكول أداة جديدة لتبسيط التصوير داخل الجسم باستخدام المجهر المقلوب متحد البؤر.

Abstract

يعد فهم السلوكيات الطبيعية والشاذة في الخلايا الحية أمرا ضروريا لتطوير التدخلات السريرية لإحباط بدء المرض وتطوره. لذلك من الأهمية بمكان تحسين مناهج التصوير التي تسهل مراقبة ديناميكيات الخلايا في الموقع ، حيث تظل بنية الأنسجة وتكوينها غير مضطربة. البشرة هي الحاجز الخارجي للجسم ، وكذلك مصدر السرطانات البشرية الأكثر انتشارا ، وهي سرطان الجلد الجلدي. توفر إمكانية الوصول إلى أنسجة الجلد فرصة فريدة لمراقبة سلوكيات الخلايا الظهارية والجلدية في السليمة باستخدام الفحص المجهري داخل الجسم غير الباضع. ومع ذلك ، فقد تم تحقيق نهج التصوير المتطور هذا في المقام الأول باستخدام المجاهر متعددة الفوتونات المستقيمة ، والتي تمثل حاجزا كبيرا أمام دخول معظم الباحثين. تقدم هذه الدراسة مجهرا مصمما خصيصا ، مطبوعا 3D ، مناسبا للاستخدام مع المجاهر متحدة البؤر المقلوبة ، مما يبسط التصوير داخل الجسم على المدى الطويل لجلد الأذن في الفئران المعدلة وراثيا الحية. نعتقد أن هذا الاختراع متعدد الاستخدامات ، والذي يمكن تخصيصه ليناسب العلامة التجارية للمجهر المقلوب والنموذج المفضل وتكييفه مع أنظمة الأعضاء الإضافية للصورة ، سيثبت أنه لا يقدر بثمن لمجتمع البحث العلمي الأكبر من خلال تعزيز إمكانية الوصول إلى الفحص المجهري داخل الجسم بشكل كبير. هذا التقدم التكنولوجي أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لديناميكيات الخلايا الحية في السياقات الطبيعية والمرضية.

Introduction

الفحص المجهري داخل الجسم هو أداة قوية تسمح بمراقبة سلوكيات الخلايا في بيئاتها غير المضطربة في الجسم الحي. قدمت هذه الطريقة الفريدة رؤى رئيسية حول الأعمال الداخلية لأنظمة أعضاء الثدييات المعقدة ، بما في ذلك الرئة¹ والدماغ² والكبد³ والغدة الثديية⁴ والأمعاء⁵ والجلد⁶. علاوة على ذلك ، كشف هذا النهج عن تغيرات سلوكية للخلايا أثناء تطور الورم⁷ ، والتئام الجروح ^8,9 ، والالتهاب¹⁰ ، وغيرها من الأمراض المتنوعة في الموقع. في هذه الدراسة ، نركز على تعزيز إمكانية الوصول إلى الفحص المجهري داخل الجسم لتصوير الديناميكيات الظهارية واللحمية الحية في جلد الفأر السليم. إن فهم سلوكيات الخلايا في جلد الثدييات له أهمية سريرية عالية بسبب القدرة التجديدية والأورام الرائعة لهذا النسيج.

تم إجراء التصوير داخل الجسم في الفئران بشكل أساسي باستخدام المجاهر متعددة الفوتونات المستقيمة نظرا لقدرتها على توفير تصوير عالي الدقة على أعماق الأنسجة >100 ميكرومتر^11,12. ومع ذلك ، تفتقر هذه الأدوات إلى تعدد استخدامات العمود الفقري وإمكانية الوصول بشكل عام للمجاهر متحدة البؤر المقلوبة ، والتي تكون أكثر سهولة في الاستخدام وفعالية من حيث التكلفة ، وتوفر القدرة على تصوير الخلايا المستزرعة ، ولا تتطلب ظلاما كاملا أثناء الحصول على الصور ، وهي أكثر أمانا بشكل عام ، من بين مزايا ملحوظة أخرى^13,14. في هذه الدراسة ، نقدم أداة جديدة تعزز بشكل كبير إمكانية الوصول إلى التصوير داخل الجسم من خلال تكييف هذا النهج للمجاهر متحدة البؤر المقلوبة.

هنا ، نقدم تصميم إدراج مرحلة مخصص مطبوع ثلاثي الأبعاد يتضمن العديد من الميزات الرئيسية لتسهيل التصوير المستقر والطويل المدى داخل الجسم لجلد أذن الفأر على مجهر متحد البؤر مقلوب (الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 ، الشكل 4 ، والشكل 5). تتضمن هذه الميزات المتخصصة ثقبا موضوعيا للإزاحة يسمح لجسم الفأر البالغ بالكامل بالاستلقاء تماما أثناء التصوير. هذا يقلل من التداخل الاهتزازي لحركات جسم الفأر على التصوير ويلغي الحاجة إلى إعطاء الكيتامين والزيلازين لتثبيط التنفس ، وهي ممارسة غالبا ما تقترن بالتصوير داخل الجسم⁶. بالإضافة إلى ذلك ، تضع أقواس الزاوية الموجودة على الملحق مخروط أنف إيزوفلوران بشكل صحيح لمحاذاة وجه الماوس ، ومشبك أذن معدني يجمد أذن الماوس إلى قرص غطاء مصمم خصيصا ، ولوحة حرارية اختيارية مغلقة الحلقة للارتجاع البيولوجي قابلة للفصل تقع داخل الملحق لدعم درجة حرارة جسم الماوس أثناء جلسات التصوير الطويلة. تم إنشاء قرص غطاء مخصص ، والذي يوفر سطحا مستويا ضروريا لرأس الفأر والأذن ليكون مسطحا ، في ورشة آلات عن طريق إزالة جدران طبق زراعة الخلايا العام الذي يحتوي على غطاء الغطاء. يوفر استخدام عدسة غمر زيت السيليكون 40x (فتحة رقمية 1.25 [N.A.] ، مسافة عمل 0.3 مم) جنبا إلى جنب مع قرص غطاء الانزلاق وإدراج المسرح المخصص صورا عالية الدقة >50 ميكرومتر في عمق أدمة الأذن.

لاختبار وظائف إدخال مرحلة المجهر المقلوب الجديد هذا ، التقطنا مداخن z تغطي جميع طبقات ظهارة البشرة على مدار 3 ساعات في أذن فأر بالغ K14-H2B-mCherry¹⁵ معدل وراثيا (تحتوي النوى الظهارية في خط الماوس هذا على ملصق فلوري أحمر) (الشكل 6A-A'). لقد التقطنا أيضا مداخن z تمتد على عدة طبقات من الخلايا الليفية داخل الأدمة الجلدية على مدار 3 ساعات في أذن Pdgfra-rtTA¹⁶ المعدلة وراثيا الحية. pTRE-H2B-GFP¹⁷ فأر بالغ (تحتوي نوى الخلايا الليفية في خط الفأر هذا على ملصق فلوري أخضر بعد تحريض الدوكسيسيكلين) (الشكل 6B-D '). تظهر بياناتنا عالية الدقة استقرارا ثابتا بسبب عدم الانجراف في المستويات x و y و z ، مما يثبت فعالية أداة التصوير الجديدة داخل الجسم هذه للاستخدام على المجاهر المقلوبة. الأهم من ذلك ، يمكن تعديل أبعاد إدراج المرحلة المطبوع ثلاثي الأبعاد ، كما هو موضح في الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3 ، لتناسب أي مجهر مقلوب ، ويمكن نقل موضع الفتحة الموضوعية إلى مواقع بديلة داخل الإدراج لتناسب بشكل أفضل تصوير نسيج معين و / أو نموذج حيواني مهم. وبالتالي يمكن لهذا الاختراع أن يمكن المختبرات الفردية ، أو الباحثين الذين لديهم وصول متحد البؤر للمنشأة الأساسية ، من تكييف هذه الأداة مع احتياجات التصوير الفريدة داخل الجسم الحيوي ، وبالتالي تبسيط تقييم بيولوجيا الخلية المتنوعة في الجسم الحي.

Protocol

تم إجراء هذا البحث وفقا لإرشادات رعاية واستخدام بجامعة إيموري والمركز الطبي لشؤون المحاربين القدامى في أتلانتا وتمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC).

1. تركيب ملحق التصوير الحي على مرحلة المجهر المقلوب

1. قم بإنشاء الإدراج باستخدام ملفات .stl (الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3) مع تحديد الأبعاد ثلاثية الأبعاد والتصميم (انظر الشكل 1 والشكل 2A) وطابعة ثلاثية الأبعاد وحمض polylactic (PLA).
2. ضع الإدراج بعناية (الشكل 2B ، C) في أخدود مرحلة المجهر الكبير (الشكل 2C والشكل 3A). استخدم البراغي لتأمين الملحق عبر أربعة ثقوب لولبية موجودة في كل ركن من أركان الملحق (الشكل 2B-C).
   ملاحظة: الملحق ثنائي الاتجاه ويمكن تدويره 180 درجة حسب اتجاه مرحلة المجهر وجهاز التخدير.
3. حرك لوحة التسخين في جانب قابس الإدخال لأسفل (الشكل 2 د) بحيث توضع الوحدة فوق أخاديد الإدخال السفلية مع مرور منفذ التوصيل أسفل المسرح (الشكل 3 ب).
4. قم بمحاذاة الفتحة الدائرية المحززة في الملحق بهدف غمر زيت السيليكون 40x (الشكل 3C) وقم بتطبيق زيت السيليكون على مركز الهدف.
   1. في حالة التصوير على مدى فترات زمنية أطول (>1 ساعة) ، ضع كمية كبيرة من الزيت الذي سيستمر عند واجهة الغطاء / الهدف طوال التصوير. لا تسمح للزيت بالانسكاب على حواف العدسة.
5. استخدم حقنة لتطبيق كمية صغيرة من شحم الفراغ على طول الفتحة الدائرية المحززة ووضع قرص غطاء الانزلاق فوقه لإغلاقه على الملحق (الشكل 3 د).
   ملاحظة: يتم إنشاء قرص الغطاء عن طريق إزالة جدران طبق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي مقاس 35 مم × 10 مم (يتم تنفيذه بواسطة ورشة آلات).
6. ارفع الهدف 40x حتى يقبل الزيت الجزء السفلي من الغطاء الزجاجي.

2. تكوين الأيزوفلوران وإعداد الماوس

1. ضع مكونات المرذاذ الإلكتروني منخفض التدفق (غرفة التخدير ، الأنبوب ، المرذاذ ، علبة الفحم) للسماح لمخروط الأنف والأنابيب المتصلة بالوصول إلى الملحق (الشكل 3 أ).
   تنبيه: Isoflurane هو مخدر استنشاق ويجب التعامل معه بحذر لتجنب الانسكابات وتقليل التعرض البشري.
2. قم بقياس وزن زجاجة الأيزوفلوران قبل الاستخدام والتسجيل. قم بتوصيل الغطاء من المرذاذ الإلكتروني بزجاجة الأيزوفلوران.
3. قم بتوصيل سلك الطاقة بالمبخر الإلكتروني. أغلق مشابك مخروط الأنف الزرقاء وافتح مشابك غرفة الحث البيضاء للسماح بتدفق الهواء عبر الحجرة إلى علبة الفحم. قم بإزالة غطاء الهواء المحيط الأحمر من الجانب الأيسر من الماكينة للسماح بتدفق الهواء.
4. اترك النظام يسخن لمدة 5 دقائق عند 200 مل / دقيقة (تدفق منخفض) و 2٪ إيزوفلوران.
   ملاحظة: على الرغم من تحديد إعداد مخروط الأنف ، يجب أن يظل خط مخروط الأنف الأزرق مغلقا ، ويجب أن يظل خط غرفة الحث الأبيض مفتوحا.
5. بمجرد موازنة النظام بشكل صحيح ، قم بتطهير الخطوط لإزالة الأيزوفلوران المتبقي من الغرفة.
6. ضع الماوس في غرفة الحث وحدد التدفق العالي. أكمل جميع تحضيرات الماوس (أي إزالة الشعر ، وتوصيل الدواء الموضعي ، وتطبيق مرهم العين ، وما إلى ذلك) قبل وضع جسم فوق الملحق. تأكد من تخدير الماوس بالكامل باستخدام طريقة منعكس قرصة إصبع القدم.
   1. مع تمديد الساق ، استخدم ظفرا لقرص إصبع القدم بإحكام دون التسبب في أضرار جسدية. إذا أظهر الفأر رد فعل إيجابي على التحفيز (أي تراجع الساق ، ارتعاش القدم ، إلخ) ، استمر في إعطاء مخدر داخل الغرفة حتى لا يلاحظ أي تفاعل. بمجرد تخديره بشكل مناسب ، يجب أن يتباطأ معدل تنفس الماوس إلى ~ 55-65 نفسا في الدقيقة¹⁸.
7. عندما يتم تخدير الماوس بالكامل ، حدد High Flow مرة أخرى لإيقاف توصيل isoflurane. قم بتطهير الحجرة قبل الفتح واضبط المشابك (أزرق: مفتوح ؛ أبيض: مغلق) لتوصيل الأيزوفلوران عبر مخروط الأنف. حدد التدفق المنخفض أثناء توصيل مخروط الأنف بالماوس لمتابعة توصيل الأيزوفلوران.
8. أنبوب إيزوفلوران خيطي مع مخروط الأنف المرفق من خلال قوس أنبوب الزاوية على الملحق (الشكل 3 أ والشكل 5).

3. وضع الماوس على إدراج للتصوير داخل الجسم

1. قم بتوصيل لوحة الحرارة بوحدة التحكم (التي تحتوي على مسبار شرجي متصل) ، وقم بتشغيلها ، واترك اللوحة تصل إلى 36 درجة مئوية (الشكل 4 أ).
2. قم بإزالة الماوس المخدر من غرفة الحث وضعه عبر لوحة الحرارة (الشكل 4B والشكل 5A). قم بإجراء النقل من الحجرة لإدخالها بسرعة لتقليل الوقت الذي يكون فيه الماوس نشطا دون تخدير استنشاقي.
3. ثبت مخروط الأنف على الماوس (الشكل 4B و C والشكل 5). إذا لزم الأمر ، استخدم الشريط اللاصق لمزيد من تأمين زاوية مخروط الأنف وموضعه.
4. أدخل المسبار الشرجي واضبط درجة حرارة وحدة التحكم حتى تستقر درجة حرارة جسم الماوس عند ~ 36 °C (الشكل 4A ، B). بعد وضع الماوس بشكل صحيح ، استخدم غلاف بلاستيكي لاحتجاز الحرارة ، إذا لزم الأمر ، لدعم درجة حرارة الجسم المناسبة (الشكل 4C).
5. ضع الماوس بحيث يحاذي الرأس قرص غطاء الغطاء وشل حركة الأذن على وسط غطاء الغطاء الزجاجي باستخدام مشبك أذن معدني (الشكل 5 أ ، ب) أو شريط (الشكل 5 ج).
   ملاحظة: يمكن ضبط ضغط مشبك الأذن المعدني على الأذن عن طريق فك المسمار الذي يثبت المشبك بالإدخال. يمكن إضافة زنبرك معدني لزيادة مرونة شد المشبك.
   1. لتغيير موقع مشبك الأذن ، قم بفك البرغي بمفتاح ألين 2.5 مم وانقله إلى الموقع الثانوي (الشكل 2B ، C). عند إعادة تجميع مشبك الأذن ، ضع المشبك مقابل الملحق ، متبوعا بالغسالة في الأعلى. استخدم مسمارا لربط المشبك بإحكام بقوة طفيفة لتدوير المشبك.
6. اضبط موضع z الموضوعي حتى تصبح الخلايا داخل المكان البؤري (الشكل 6A ، D). قم بتعيين معلمات z-stack والفاصل الزمني وفقا للأهداف التجريبية وابدأ في الحصول على الصور.
   ملاحظة: إذا تم تحقيق الإعداد الصحيح ، فيمكن تصوير أذن الماوس لمدة 3 ساعات متتالية على الأقل (الشكل 6A '، D').
   1. بمجرد تعيين حدود مكدس z ، اضبط طاقة الليزر والكسب لضمان عدم تشبع مستوى z لتقليل التبييض الضوئي. حدد معلمات الفاصل الزمني باستخدام السماكة الكلية لمكدس z وأرقام الخطوات (يوصى بأخذ عينات Nyquist) والفترات الزمنية.
   2. تحديد معلمات التصوير (الفترات الزمنية ، إجمالي وقت التصوير ، إلخ) باستخدام عوامل متعددة ، بما في ذلك صلاحية تحت التخدير ، والتبييض الضوئي / السمية الضوئية الناجم عن الليزر ، والهدف من التصوير الحي (أي ديناميكيات انقسام الخلايا ، والتفاعلات بين الخلايا والخلايا ، وما إلى ذلك).

4. إنهاء التصوير

1. قم بتشغيل الوسادة الحرارية التي تدور حول الماء واضبطها على دورة مستمرة و 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل إنهاء التقاط الصورة.
2. عند الانتهاء من التصوير ، حدد Low Flow على المرذاذ الإلكتروني لإيقاف توصيل isoflurane وحرك الماوس إلى وسادة حرارية حتى يصبح متنقلا.
3. بمجرد الاستيقاظ ، حرك الماوس مرة أخرى إلى حاوية النقل مع الاستمرار في الحفاظ على وسادة حرارية حتى يصبح متنقلا بالكامل. راقب الماوس باستمرار أثناء وجوده على وسادة الحرارة حتى يستجيب.
4. على المرذاذ الإلكتروني، انقر فوق تحديد القائمة > التحكم في التخدير > فارغ. قم بإزالة زجاجة الأيزوفلوران من النظام وضع غطاء الشركة المصنعة مرة أخرى على الزجاجة.
5. قم بقياس وزن زجاجة الأيزوفلوران وعلبة الفحم وأدخل الأوزان في السجل. بمجرد أن تزن علبة الفحم 50 جم فوق قياس خط الأساس ، تخلص من العلبة واستبدلها بوحدة جديدة. أعد الأيزوفلوران إلى صندوق التأمين.
6. قم بإزالة قرص قسيمة الغطاء وامسحه بورق العدسة ومحلول العدسة. تخزينها بشكل صحيح لتجنب الخدوش لإعادة استخدامها.
7. قم بإزالة أنبوب التخدير من كتيفة الإدخال وفك الإدخال من مرحلة المجهر.

النتائج

يتم التحقق من صحة التجميع الصحيح لإدراج التصوير الحي على مجهر متحد البؤر مقلوب والاتجاه المناسب للماوس المعدل وراثيا فوق الملحق من خلال الحصول على أكوام z من أنسجة الأذن الحية ذات العلامات الفلورية على مدار فترة زمنية ≥1 ساعة مع الحد الأدنى من الأدلة على الانجراف في المحاور x و y و z. يجب الت...

Discussion

في هذه الدراسة ، نقدم أداة جديدة تسهل التصوير المستقر والطويل الأمد داخل الجسم لظهارة جلد الفأر السليمة على المجاهر متحدة البؤر المقلوبة. يتكون هذا الاختراع من جيش التحرير الشعبى الصينى, وهو الأكثر شيوعا وغير مكلفة 3D المواد القابلة للطباعة; جميع تكاليف الطباعة ثلاثية الأبعاد الداخلية له?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging