A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم البروتوكول أداة جديدة لتبسيط التصوير داخل الجسم باستخدام المجهر المقلوب متحد البؤر.

Abstract

يعد فهم السلوكيات الطبيعية والشاذة في الخلايا الحية أمرا ضروريا لتطوير التدخلات السريرية لإحباط بدء المرض وتطوره. لذلك من الأهمية بمكان تحسين مناهج التصوير التي تسهل مراقبة ديناميكيات الخلايا في الموقع ، حيث تظل بنية الأنسجة وتكوينها غير مضطربة. البشرة هي الحاجز الخارجي للجسم ، وكذلك مصدر السرطانات البشرية الأكثر انتشارا ، وهي سرطان الجلد الجلدي. توفر إمكانية الوصول إلى أنسجة الجلد فرصة فريدة لمراقبة سلوكيات الخلايا الظهارية والجلدية في السليمة باستخدام الفحص المجهري داخل الجسم غير الباضع. ومع ذلك ، فقد تم تحقيق نهج التصوير المتطور هذا في المقام الأول باستخدام المجاهر متعددة الفوتونات المستقيمة ، والتي تمثل حاجزا كبيرا أمام دخول معظم الباحثين. تقدم هذه الدراسة مجهرا مصمما خصيصا ، مطبوعا 3D ، مناسبا للاستخدام مع المجاهر متحدة البؤر المقلوبة ، مما يبسط التصوير داخل الجسم على المدى الطويل لجلد الأذن في الفئران المعدلة وراثيا الحية. نعتقد أن هذا الاختراع متعدد الاستخدامات ، والذي يمكن تخصيصه ليناسب العلامة التجارية للمجهر المقلوب والنموذج المفضل وتكييفه مع أنظمة الأعضاء الإضافية للصورة ، سيثبت أنه لا يقدر بثمن لمجتمع البحث العلمي الأكبر من خلال تعزيز إمكانية الوصول إلى الفحص المجهري داخل الجسم بشكل كبير. هذا التقدم التكنولوجي أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لديناميكيات الخلايا الحية في السياقات الطبيعية والمرضية.

Introduction

الفحص المجهري داخل الجسم هو أداة قوية تسمح بمراقبة سلوكيات الخلايا في بيئاتها غير المضطربة في الجسم الحي. قدمت هذه الطريقة الفريدة رؤى رئيسية حول الأعمال الداخلية لأنظمة أعضاء الثدييات المعقدة ، بما في ذلك الرئة1 والدماغ2 والكبد3 والغدة الثديية4 والأمعاء5 والجلد6. علاوة على ذلك ، كشف هذا النهج عن تغيرات سلوكية للخلايا أثناء تطور الورم7 ، والتئام الجروح 8,9 ، والالتهاب10 ، وغيرها من الأمراض المتنوعة في الموقع.<....

Protocol

تم إجراء هذا البحث وفقا لإرشادات رعاية واستخدام بجامعة إيموري والمركز الطبي لشؤون المحاربين القدامى في أتلانتا وتمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC).

1. تركيب ملحق التصوير الحي على مرحلة المجهر المقلوب

  1. قم بإنشاء الإدراج باستخدام ملفات .stl (الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3) مع تحديد الأبعاد ثلاثية الأبعاد والتصميم (انظر الشكل 1 والشكل 2A) وطابعة ثلاثية الأبعاد وحمض polylactic (PLA).
  2. ضع الإدراج بعناية (الشكل 2B ، C) في ....

النتائج

يتم التحقق من صحة التجميع الصحيح لإدراج التصوير الحي على مجهر متحد البؤر مقلوب والاتجاه المناسب للماوس المعدل وراثيا فوق الملحق من خلال الحصول على أكوام z من أنسجة الأذن الحية ذات العلامات الفلورية على مدار فترة زمنية ≥1 ساعة مع الحد الأدنى من الأدلة على الانجراف في المحاور x و y و z. يجب الت.......

Discussion

في هذه الدراسة ، نقدم أداة جديدة تسهل التصوير المستقر والطويل الأمد داخل الجسم لظهارة جلد الفأر السليمة على المجاهر متحدة البؤر المقلوبة. يتكون هذا الاختراع من جيش التحرير الشعبى الصينى, وهو الأكثر شيوعا وغير مكلفة 3D المواد القابلة للطباعة; جميع تكاليف الطباعة ثلاثية الأبعاد الداخلية له?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

نشكر فالنتينا جريكو على الفئران K14-mCherry-H2B. نحن ممتنون لورشة آلات قسم الفيزياء بجامعة إيموري لتوليد أقراص الغطاء الزجاجي. تم تمويل هذا العمل من قبل جائزة التطوير الوظيفي #IK2 BX005370 من خدمة BLRD التابعة لوزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية إلى LS ، وجوائز NIH RF1-AG079269 و R56-AG072473 إلى MJMR ، وجائزة I3 Emory SOM / GT الحاسوبية وتحليل البيانات إلى MJMR.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3D PrinterQudi Techi-Fast3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lensNikon
AxR Laser Scanning Confocal MicroscopeNikon
Cotton Tipped SwabVWR76337-046Cream/ointment application
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)NikonScrew insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dishchemglass Life SciencesCLS-1811-002Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controllerPhysitempTCAT-2LVAnimal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
IsofluraneMed-Vet InternationalHPA030782-100uLMouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)VWR10127-458Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastenerused as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:034459Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherryCourtesy of Dr. Valentina Greco at Yale UniversityLabels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK
Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J
The Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:005104 Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing WrapGladEnhance mouse warmth
OptixcareVWRMSPP-078932779Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)ThorlabsSS3M6Attachment for heatplate module
Silicone Immersion OilApplied to 40x silicone objective
Small Animal Heating PlatePhysitempHP-4MProvides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic VaporizerKent ScientificSF-01Mouse anesthesia
Vacuum GreaseFlinn ScientificAP1095Seals coverslip disk to insert
Veethair removal 
Water circulating heat padStryker MedicalTP700for mouse revival post-imaging

References

  1. Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
  2. Nal Chen, ., et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after bi....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved