نهج التصوير داخل الجسم المبسط للمراقبة طويلة المدى لديناميكيات الأنسجة الظهارية على مجهر متحد البؤر مقلوب

Summary

يقدم البروتوكول أداة جديدة لتبسيط التصوير داخل الجسم باستخدام المجهر المقلوب متحد البؤر.

Abstract

يعد فهم السلوكيات الطبيعية والشاذة في الخلايا الحية أمرا ضروريا لتطوير التدخلات السريرية لإحباط بدء المرض وتطوره. لذلك من الأهمية بمكان تحسين مناهج التصوير التي تسهل مراقبة ديناميكيات الخلايا في الموقع ، حيث تظل بنية الأنسجة وتكوينها غير مضطربة. البشرة هي الحاجز الخارجي للجسم ، وكذلك مصدر السرطانات البشرية الأكثر انتشارا ، وهي سرطان الجلد الجلدي. توفر إمكانية الوصول إلى أنسجة الجلد فرصة فريدة لمراقبة سلوكيات الخلايا الظهارية والجلدية في السليمة باستخدام الفحص المجهري داخل الجسم غير الباضع. ومع ذلك ، فقد تم تحقيق نهج التصوير المتطور هذا في المقام الأول باستخدام المجاهر متعددة الفوتونات المستقيمة ، والتي تمثل حاجزا كبيرا أمام دخول معظم الباحثين. تقدم هذه الدراسة مجهرا مصمما خصيصا ، مطبوعا 3D ، مناسبا للاستخدام مع المجاهر متحدة البؤر المقلوبة ، مما يبسط التصوير داخل الجسم على المدى الطويل لجلد الأذن في الفئران المعدلة وراثيا الحية. نعتقد أن هذا الاختراع متعدد الاستخدامات ، والذي يمكن تخصيصه ليناسب العلامة التجارية للمجهر المقلوب والنموذج المفضل وتكييفه مع أنظمة الأعضاء الإضافية للصورة ، سيثبت أنه لا يقدر بثمن لمجتمع البحث العلمي الأكبر من خلال تعزيز إمكانية الوصول إلى الفحص المجهري داخل الجسم بشكل كبير. هذا التقدم التكنولوجي أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لديناميكيات الخلايا الحية في السياقات الطبيعية والمرضية.

Introduction

الفحص المجهري داخل الجسم هو أداة قوية تسمح بمراقبة سلوكيات الخلايا في بيئاتها غير المضطربة في الجسم الحي. قدمت هذه الطريقة الفريدة رؤى رئيسية حول الأعمال الداخلية لأنظمة أعضاء الثدييات المعقدة ، بما في ذلك الرئة¹ والدماغ² والكبد³ والغدة الثديية⁴ والأمعاء⁵ والجلد⁶. علاوة على ذلك ، كشف هذا النهج عن تغيرات سلوكية للخلايا أثناء تطور الورم⁷ ، والتئام الجروح ^8,9 ، والالتهاب¹⁰ ، وغيرها من الأمراض المتنوعة في الموقع.^<....

Protocol

تم إجراء هذا البحث وفقا لإرشادات رعاية واستخدام بجامعة إيموري والمركز الطبي لشؤون المحاربين القدامى في أتلانتا وتمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC).

1. تركيب ملحق التصوير الحي على مرحلة المجهر المقلوب

1. قم بإنشاء الإدراج باستخدام ملفات .stl (الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3) مع تحديد الأبعاد ثلاثية الأبعاد والتصميم (انظر الشكل 1 والشكل 2A) وطابعة ثلاثية الأبعاد وحمض polylactic (PLA).
2. ضع الإدراج بعناية (الشكل 2B ، C) في ....

النتائج

يتم التحقق من صحة التجميع الصحيح لإدراج التصوير الحي على مجهر متحد البؤر مقلوب والاتجاه المناسب للماوس المعدل وراثيا فوق الملحق من خلال الحصول على أكوام z من أنسجة الأذن الحية ذات العلامات الفلورية على مدار فترة زمنية ≥1 ساعة مع الحد الأدنى من الأدلة على الانجراف في المحاور x و y و z. يجب الت.......

Discussion

في هذه الدراسة ، نقدم أداة جديدة تسهل التصوير المستقر والطويل الأمد داخل الجسم لظهارة جلد الفأر السليمة على المجاهر متحدة البؤر المقلوبة. يتكون هذا الاختراع من جيش التحرير الشعبى الصينى, وهو الأكثر شيوعا وغير مكلفة 3D المواد القابلة للطباعة; جميع تكاليف الطباعة ثلاثية الأبعاد الداخلية له?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging