A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يقدم البروتوكول أداة جديدة لتبسيط التصوير داخل الجسم باستخدام المجهر المقلوب متحد البؤر.
يعد فهم السلوكيات الطبيعية والشاذة في الخلايا الحية أمرا ضروريا لتطوير التدخلات السريرية لإحباط بدء المرض وتطوره. لذلك من الأهمية بمكان تحسين مناهج التصوير التي تسهل مراقبة ديناميكيات الخلايا في الموقع ، حيث تظل بنية الأنسجة وتكوينها غير مضطربة. البشرة هي الحاجز الخارجي للجسم ، وكذلك مصدر السرطانات البشرية الأكثر انتشارا ، وهي سرطان الجلد الجلدي. توفر إمكانية الوصول إلى أنسجة الجلد فرصة فريدة لمراقبة سلوكيات الخلايا الظهارية والجلدية في السليمة باستخدام الفحص المجهري داخل الجسم غير الباضع. ومع ذلك ، فقد تم تحقيق نهج التصوير المتطور هذا في المقام الأول باستخدام المجاهر متعددة الفوتونات المستقيمة ، والتي تمثل حاجزا كبيرا أمام دخول معظم الباحثين. تقدم هذه الدراسة مجهرا مصمما خصيصا ، مطبوعا 3D ، مناسبا للاستخدام مع المجاهر متحدة البؤر المقلوبة ، مما يبسط التصوير داخل الجسم على المدى الطويل لجلد الأذن في الفئران المعدلة وراثيا الحية. نعتقد أن هذا الاختراع متعدد الاستخدامات ، والذي يمكن تخصيصه ليناسب العلامة التجارية للمجهر المقلوب والنموذج المفضل وتكييفه مع أنظمة الأعضاء الإضافية للصورة ، سيثبت أنه لا يقدر بثمن لمجتمع البحث العلمي الأكبر من خلال تعزيز إمكانية الوصول إلى الفحص المجهري داخل الجسم بشكل كبير. هذا التقدم التكنولوجي أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لديناميكيات الخلايا الحية في السياقات الطبيعية والمرضية.
الفحص المجهري داخل الجسم هو أداة قوية تسمح بمراقبة سلوكيات الخلايا في بيئاتها غير المضطربة في الجسم الحي. قدمت هذه الطريقة الفريدة رؤى رئيسية حول الأعمال الداخلية لأنظمة أعضاء الثدييات المعقدة ، بما في ذلك الرئة1 والدماغ2 والكبد3 والغدة الثديية4 والأمعاء5 والجلد6. علاوة على ذلك ، كشف هذا النهج عن تغيرات سلوكية للخلايا أثناء تطور الورم7 ، والتئام الجروح 8,9 ، والالتهاب10 ، وغيرها من الأمراض المتنوعة في الموقع.<....
تم إجراء هذا البحث وفقا لإرشادات رعاية واستخدام بجامعة إيموري والمركز الطبي لشؤون المحاربين القدامى في أتلانتا وتمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC).
1. تركيب ملحق التصوير الحي على مرحلة المجهر المقلوب
يتم التحقق من صحة التجميع الصحيح لإدراج التصوير الحي على مجهر متحد البؤر مقلوب والاتجاه المناسب للماوس المعدل وراثيا فوق الملحق من خلال الحصول على أكوام z من أنسجة الأذن الحية ذات العلامات الفلورية على مدار فترة زمنية ≥1 ساعة مع الحد الأدنى من الأدلة على الانجراف في المحاور x و y و z. يجب الت.......
في هذه الدراسة ، نقدم أداة جديدة تسهل التصوير المستقر والطويل الأمد داخل الجسم لظهارة جلد الفأر السليمة على المجاهر متحدة البؤر المقلوبة. يتكون هذا الاختراع من جيش التحرير الشعبى الصينى, وهو الأكثر شيوعا وغير مكلفة 3D المواد القابلة للطباعة; جميع تكاليف الطباعة ثلاثية الأبعاد الداخلية له?.......
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
نشكر فالنتينا جريكو على الفئران K14-mCherry-H2B. نحن ممتنون لورشة آلات قسم الفيزياء بجامعة إيموري لتوليد أقراص الغطاء الزجاجي. تم تمويل هذا العمل من قبل جائزة التطوير الوظيفي #IK2 BX005370 من خدمة BLRD التابعة لوزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية إلى LS ، وجوائز NIH RF1-AG079269 و R56-AG072473 إلى MJMR ، وجائزة I3 Emory SOM / GT الحاسوبية وتحليل البيانات إلى MJMR.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
Intravital Imaging Insert | |||
Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
Metal fastener | used as ear clip | ||
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
Veet | hair removal | ||
Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved