Enfoque simplificado de imágenes intravitales para la monitorización a largo plazo de la dinámica del tejido epitelial en un microscopio confocal invertido

Resumen

El protocolo presenta una nueva herramienta para simplificar la obtención de imágenes intravitales mediante microscopía confocal invertida.

Resumen

Comprender los comportamientos normales y aberrantes de las células in vivo es necesario para desarrollar intervenciones clínicas que frustren el inicio y la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, es fundamental optimizar los enfoques de imagen que faciliten la observación de la dinámica celular in situ, donde la estructura y la composición de los tejidos permanecen inalteradas. La epidermis es la barrera más externa del cuerpo, así como la fuente de los cánceres humanos más prevalentes, a saber, los carcinomas cutáneos de piel. La accesibilidad del tejido cutáneo presenta una oportunidad única para monitorizar el comportamiento de las células epiteliales y dérmicas en animales intactos mediante microscopía intravital no invasiva. Sin embargo, este sofisticado enfoque de imagen se ha logrado principalmente utilizando microscopios multifotónicos verticales, que representan una barrera de entrada significativa para la mayoría de los investigadores. Este estudio presenta un inserto de platina de microscopio impreso en 3D diseñado a medida y adecuado para su uso con microscopios confocales invertidos, lo que agiliza la obtención de imágenes intravitales a largo plazo de la piel del oído en ratones transgénicos vivos. Creemos que esta versátil invención, que puede personalizarse para adaptarse a la marca y el modelo de microscopio invertido de elección y adaptarse a la obtención de imágenes de sistemas de órganos adicionales, resultará invaluable para la comunidad de investigación científica en general al mejorar significativamente la accesibilidad de la microscopía intravital. Este avance tecnológico es fundamental para reforzar nuestra comprensión de la dinámica de las células vivas en contextos normales y de enfermedad.

Introducción

La microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite el monitoreo de los comportamientos celulares en sus ambientes in vivo no perturbados. Este método único ha proporcionado información clave sobre el funcionamiento interno de los complejos sistemas de órganos de los mamíferos, incluidos el pulmón¹, el cerebro², el hígado³, la glándula mamaria⁴, el intestino⁵ y la piel⁶. Además, este enfoque ha revelado alteraciones del comportamiento celular durante el desarrollo tumoral^7,

Protocolo

Esta investigación se realizó de acuerdo con las pautas de cuidado y uso de animales de la Universidad de Emory y el Centro Médico de Asuntos de Veteranos de Atlanta y ha sido aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

1. Instalación del inserto de imágenes en vivo en la platina del microscopio invertido

1. Construya la inserción utilizando archivos .stl (Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3) especificando las dimensiones y el diseño 3D (consulte la Figura 1 y la Figura 2A....

Discusión

En este estudio, presentamos una nueva herramienta que facilita la obtención de imágenes intravitales estables y a largo plazo de epitelios de piel de ratón intactos en microscopios confocales invertidos. Este invento está hecho de PLA, que es el material imprimible en 3D más común y económico; todos los costes internos de impresión 3D de este inserto ascienden a 5 < dólares. Las dos piezas de inserción separadas (Figura 1, Archivo Suplementario 1 y Lima Su.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging