Оптимизированный подход к прижизненной визуализации для долгосрочного мониторинга динамики эпителиальных тканей на инвертированном конфокальном микроскопе

Резюме

Протокол представляет собой новый инструмент для упрощения прижизненной визуализации с помощью инвертированной конфокальной микроскопии.

Аннотация

Понимание нормального и аберрантного поведения клеток in vivo необходимо для разработки клинических вмешательств, направленных на предотвращение начала и прогрессирования заболевания. Поэтому крайне важно оптимизировать подходы к визуализации, которые облегчают наблюдение за клеточной динамикой in situ, когда структура и состав тканей остаются неизменными. Эпидермис является самым внешним барьером организма, а также источником наиболее распространенных видов рака человека, а именно кожных карцином. Доступность кожных тканей предоставляет уникальную возможность мониторинга поведения эпителиальных и дермальных клеток у интактных животных с помощью неинвазивной прижизненной микроскопии. Тем не менее, этот сложный подход к визуализации в основном был достигнут с помощью вертикальных многофотонных микроскопов, которые представляют собой значительный барьер для входа для большинства исследователей. В этом исследовании представлена специально разработанная, напечатанная на 3D-принтере вставка для микроскопа, подходящая для использования с инвертированными конфокальными микроскопами, оптимизирующая долгосрочную прижизненную визуализацию кожи уха у живых трансгенных мышей. Мы считаем, что это универсальное изобретение, которое может быть адаптировано к выбранной марке и модели инвертированного микроскопа и адаптировано для визуализации дополнительных систем органов, окажется бесценным для более широкого научно-исследовательского сообщества, значительно повысив доступность прижизненной микроскопии. Этот технологический прогресс имеет решающее значение для укрепления нашего понимания динамики живых клеток в нормальном и болезненном контекстах.

Введение

Прижизненная микроскопия является мощным инструментом, который позволяет отслеживать поведение клеток в их невозмущенной среде in vivo. Этот уникальный метод позволил получить ключевое представление о внутренней работе сложных систем органов млекопитающих, включая легкое¹, мозг², печень³, молочную железу⁴, кишечник⁵ и кожу⁶. Кроме того, этот подход выявил поведенческие изменения клеток во время развития опухоли^7, заживления ран^8,9, воспаления¹⁰ и других разнообразных патологий in situ. В этом исследовании мы сосредоточимся на улучшении доступности прижизненной микроскопии для визуализации динамики живого эпителия и стромы в интактной коже мышей. Понимание поведения клеток в коже млекопитающих имеет большое клиническое значение из-за замечательной регенеративной и опухолегенной способности этой ткани.

Прижизненная визуализация у мышей в основном выполнялась с помощью вертикальных многофотонных микроскопов из-за их способности обеспечивать визуализацию с высоким разрешением на глубине тканей >100 мкм^11,12. Тем не менее, этим инструментам не хватает универсальности «рабочей лошадки» и более широкой доступности, присущей инвертированным конфокальным микроскопам, которые более удобны в использовании и экономичны, обеспечивают возможность получения изображений культивируемых клеток, не требуют полной темноты во время получения изображения и, как правило, более безопасны, среди других заметных преимуществ^13,14. В этом исследовании мы представляем новый инструмент, который значительно повышает доступность прижизненной визуализации за счет адаптации этого подхода для инвертированных конфокальных микроскопов.

В этой статье мы представляем напечатанную на 3D-принтере конструкцию вставки, которая включает в себя несколько ключевых функций, облегчающих стабильную, долгосрочную прижизненную визуализацию кожи уха мыши на инвертированном конфокальном микроскопе (рис. 1, рис. 2, рис. 3, рис. 4 и рис. 5). Эти специализированные функции включают смещенное отверстие объектива, которое позволяет всему телу взрослой мыши лежать полностью горизонтально во время визуализации. Это сводит к минимуму вибрационную интерференцию движений тела мыши при визуализации и устраняет необходимость введения кетамина и ксилазина для ослабления дыхания, что часто сочетается с прижизненной визуализацией⁶. Кроме того, угловые кронштейны на вставке правильно позиционируют носовой конус изофлурана так, чтобы он совпадал с лицевой стороной мыши, металлический ушной зажим обездвиживает ухо мыши к специально изготовленному покровному диску, а дополнительная съемная нагревательная пластина с обратной связью с обратной связью находится заподлицо со вставкой для поддержания температуры тела мыши во время длительных сеансов визуализации. Изготовленный на заказ диск для покровного стекла, который обеспечивает плоскую поверхность, необходимую для того, чтобы голова и ухо мыши лежали ровно, был создан в механическом цехе путем удаления стенок универсальной чашки с клеточной культурой, содержащей покровное стекло. Использование 40-кратной иммерсионной линзы с силиконовым маслом (числовая апертура 1,25, рабочее расстояние 0,3 мм) в сочетании с покровным диском и специальной вставкой столика позволяет получать изображения с высоким разрешением >50 мкм вглубь ушной кожи.

Чтобы проверить функциональность этого нового вкладыша для инвертированного микроскопа, мы захватили z-стеки, охватывающие все эпидермальные эпителиальные слои, в течение 3 часов в ухе живой трансгенной взрослой мыши K14-H2B-mCherry¹⁵ (эпителиальные ядра в этой линии мышей содержат красную флуоресцентную метку) (рис. 6A-A'). Мы также зафиксировали z-стеки, охватывающие несколько слоев фибробластов в дерме кожи в течение 3 ч в ухе живого трансгенного Pdgfra-rtTA¹⁶; Взрослая мышь pTRE-H2B-GFP¹⁷ (ядра фибробластов в этой линии мышей содержат зеленую флуоресцентную метку после индукции доксициклина) (рис. 6B-D'). Наши данные с высоким разрешением демонстрируют стабильную стабильность благодаря отсутствию дрейфа в плоскостях x, y и z, тем самым доказывая эффективность этого нового инструмента прижизненной визуализации для использования на инвертированных микроскопах. Важно отметить, что размеры этой напечатанной на 3D-принтере вставки можно регулировать, как описано в Дополнительном файле 1, Дополнительном файле 2 и Дополнительном файле 3, чтобы соответствовать любому инвертированному микроскопу, а расположение отверстия объектива может быть перемещено в альтернативные места внутри вставки, чтобы лучше подходить для визуализации конкретной интересующей модели ткани и/или животного. Таким образом, это изобретение может дать возможность отдельным лабораториям или исследователям, имеющим конфокальный доступ к основному оборудованию, адаптировать этот инструмент для своих уникальных потребностей в прижизненной визуализации, тем самым оптимизируя оценку разнообразной клеточной биологии in vivo.

протокол

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями по уходу за животными и использованию Медицинского центра по делам ветеранов Университета Эмори и Атланты и было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC).

1. Установка вставки для получения изображений в реальном времени на столик инвертированного микроскопа

1. Создайте вставку с помощью файлов .stl (Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 3), указав 3D-размеры и конструкцию (см. рис. 1 и Рисунок 2A), 3D-принтер и полимолочную кислоту (PLA).
2. Осторожно поместите вкладыш (Рисунок 2B, C) в канавку большого столика микроскопа (Рисунок 2C и Рисунок 3A). Используйте винты, чтобы закрепить пластину с помощью четырех отверстий для винтов, расположенных в каждом углу пластины (Рисунок 2B-C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладыш является двунаправленным и может поворачиваться на 180° в зависимости от ориентации предметного столика микроскопа и наркозного аппарата.
3. Вставьте нагревательную пластину во врезную вилку стороной вниз (Рисунок 2D) так, чтобы устройство лежало поверх нижних канавок вставки, а порт вилки проходил под столиком (Рисунок 3B).
4. Совместите рифленое круглое отверстие во вставке с помощью 40-кратного погружного объектива с силиконовым маслом (рис. 3C) и нанесите силиконовое масло на центр объектива.
   1. Если визуализация выполняется в течение более длительных периодов времени (>1 ч), нанесите обильную ложку масла, которое будет сохраняться на границе покровного стекла и объектива на протяжении всей визуализации. Не допускайте попадания масла за края объектива.
5. С помощью шприца нанесите небольшое количество вакуумной смазки вдоль желобчатого круглого отверстия и положите сверху покровный скользящий диск для герметизации на вкладыше (Рисунок 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Покровный скользящий диск создается путем удаления стенок чашки для клеточных культур со стеклянным дном размером 35 мм x 10 мм (выполняется в механическом цехе).
6. Поднимите объектив 40x до тех пор, пока масло не коснется нижней части стеклянного покровного стекла.

2. Конфигурация изофлурана и подготовка мыши

1. Расположите компоненты электронного испарителя с низким расходом (наркозную камеру, трубку, испаритель, канистру с древесным углем) так, чтобы носовой конус и прикрепленная трубка достигли вкладыша (Рисунок 3A).
   ВНИМАНИЕ: Изофлуран является ингаляционным анестетиком, и с ним следует обращаться осторожно, чтобы избежать разливов и свести к минимуму воздействие на человека.
2. Измерьте вес флакона с изофлураном перед использованием и зарегистрируйте. Прикрепите колпачок от электронного испарителя к бутылке с изофлураном.
3. Подключите шнур питания к электронному испарителю. Закройте синие зажимы носового конуса и откройте белые зажимы индукционной камеры, чтобы обеспечить поток воздуха через камеру в канистру с углем. Снимите красную крышку окружающего воздуха с левой стороны машины, чтобы обеспечить приток воздуха.
4. Дайте системе прогреться в течение 5 минут при 200 мл/мин (низкий расход) и 2% изофлуране.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что выбрана настройка носового обтекателя, синяя линия носового обтекателя должна оставаться закрытой, а белая линия индукционной камеры должна оставаться открытой.
5. После того, как система будет правильно сбалансирована, продуйте трубопроводы, чтобы удалить оставшийся изофлуран из камеры.
6. Поместите мышь в индукционную камеру и выберите High Flow (Высокий расход). Завершите всю подготовку мыши (например, удаление шерсти, местное введение лекарства, нанесение глазной мази и т. д.) перед тем, как положить тело животного на вкладыш. Убедитесь, что мышь полностью обезболина, используя метод рефлекса сжатия пальцев ног.
   1. Вытянув ногу, сильно зажмите палец ногтем, не причиняя физического вреда. Если мышь демонстрирует положительную реакцию на раздражитель (например, втягивание ноги, подергивание стопы и т. д.), продолжайте вводить анестетик в камере до тех пор, пока не будет наблюдаться отсутствие реакции. После соответствующего обезболивания частота дыхания мыши должна замедлиться до ~55-65 вдохов в минуту¹⁸.
7. Когда мышь будет полностью обезболина, снова выберите «Высокий поток», чтобы остановить подачу изофлурана. Перед открытием продуйте камеру и отрегулируйте зажимы (синий: открыт; белый: закрыт) для подачи изофлурана через носовой обтекатель. Выберите Low Flow (Низкий расход), когда носовой обтекатель прикреплен к мыши, чтобы продолжить подачу изофлурана.
8. Проденьте трубку изофлурана с прикрепленным носовым конусом через угловой кронштейн трубки на вставке (Рисунок 3А и Рисунок 5).

3. Размещение мыши на вкладыше для прижизненной визуализации

1. Подключите нагревательную пластину к контроллеру (с прикрепленным анальным зондом), включите питание и дайте пластине нагреться до 36 °C (Рисунок 4A).
2. Извлеките обезболиваемую мышь из индукционной камеры и положите ее поперек нагревательной пластины (Рисунок 4B и Рисунок 5A). Выполняйте перенос из камеры во вставку быстро, чтобы свести к минимуму время активности мыши без ингаляционной анестезии.
3. Закрепите носовой обтекатель на мыши (рис. 4B, C и рис. 5). При необходимости используйте скотч для дополнительной фиксации угла и положения носового обтекателя.
4. Вставьте анальный зонд и отрегулируйте температуру контроллера до тех пор, пока температура тела мыши не станет стабильной на уровне ~36 °C (рис. 4A,B). После того, как мышь будет правильно расположена, при необходимости используйте полиэтиленовую пищевую пленку, чтобы удерживать тепло и поддерживать соответствующую температуру тела (рис. 4C).
5. Расположите мышь так, чтобы головка совпала с покровным диском, и иммобилизуйте ухо по центру стеклянного покровного стекла с помощью металлического зажима для ушей (Рисунок 5A, B) или ленты (Рисунок 5C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Давление металлического зажима на ухо можно отрегулировать, ослабив винт, который крепит зажим к вкладышу. Металлическая пружина может быть добавлена для повышения гибкости затяжки клипсы.
   1. Чтобы изменить положение ушного зажима, открутите болт шестигранным ключом на 2,5 мм и перенесите его на вторичное место (рис. 2B, C). При повторной сборке ушного зажима приложите зажим к вкладышу, а затем шайбу сверху. Используйте болт, чтобы надежно закрепить зажим с небольшим усилием, чтобы повернуть зажим.
6. Отрегулируйте z-положение объектива до тех пор, пока ячейки не окажутся в фокусном месте (рис. 6A, D). Установите параметры z-стека и интервальной съемки в соответствии с целями эксперимента и приступайте к получению изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если достигнута правильная настройка, ухо мыши можно визуализировать в течение не менее 3 часов подряд (Рисунок 6A',D').
   1. После того, как границы z-стека установлены, отрегулируйте мощность и усиление лазера, чтобы убедиться, что z-плоскость не перенасыщена, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание. Определите параметры интервальной съемки, используя общую толщину z-стека, количество шагов (рекомендуется выборка по Найквисту) и временные интервалы.
   2. Определите параметры визуализации (временные интервалы, общее время визуализации и т. д.), используя множество факторов, включая жизнеспособность животных под наркозом, лазерно-индуцированное фотообесцвечивание/фототоксичность и цель визуализации в реальном времени (т. е. динамика деления клеток, межклеточные взаимодействия и т. д.).

4. Прекращение визуализации

1. Включите грелку с циркуляцией воды и установите режим непрерывного цикла и температуру 35 °C не менее чем за 30 минут до завершения получения изображения.
2. После завершения визуализации выберите низкий расход на электронном испарителе, чтобы остановить подачу изофлурана, и переместите мышь на грелку до тех пор, пока она не станет амбулаторной.
3. После пробуждения переместите мышь обратно в контейнер для переноса, продолжая держать ее на грелке до тех пор, пока она полностью не станет самостоятельной. Постоянно следите за мышью, пока она не начнет реагировать.
4. На электронном испарителе нажмите «Выбрать меню» > « Управление анестезией» > «Пусто». Извлеките флакон с изофлураном из системы и снова наденьте на него крышку производителя.
5. Измерьте вес бутылки с изофлураном и канистры с древесным углем и введите вес в журнал. Как только канистра с углем будет весить на 50 г больше базового измерения, утилизируйте канистру и замените ее новой единицей. Верните изофлуран в сейф.
6. Снимите защитный диск и протрите его бумагой для линз и раствором для линз. Храните правильно, чтобы избежать царапин при повторном использовании.
7. Снимите трубку для анестезии с кронштейна вкладыша и отвинтите вкладыш от предметного столика микроскопа.

Результаты

Правильная сборка вставки с изображением в реальном времени на инвертированном конфокальном микроскопе и правильная ориентация трансгенной мыши на вставке подтверждается путем получения z-стеков флуоресцентно меченной живой ушной ткани в течение ≥1 ч с минимальными признаками дрей?...

Обсуждение

В этом исследовании мы представляем новый инструмент, который обеспечивает стабильную, долгосрочную прижизненную визуализацию интактного эпителия кожи мышей на инвертированных конфокальных микроскопах. Это изобретение изготовлено из PLA, который является наиболее распространенным ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging