Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

Özet

Protokol, ters konfokal mikroskopi kullanarak intravital görüntülemeyi basitleştirmek için yeni bir araç sunar.

Özet

Normal ve anormal in vivo hücre davranışlarını anlamak, hastalığın başlamasını ve ilerlemesini engellemek için klinik müdahaleler geliştirmek için gereklidir. Bu nedenle, doku yapısının ve bileşiminin bozulmadan kaldığı hücre dinamiklerinin yerinde gözlemlenmesini kolaylaştıran görüntüleme yaklaşımlarını optimize etmek çok önemlidir. Epidermis, vücudun en dış bariyeri ve aynı zamanda en yaygın insan kanserlerinin, yani kutanöz cilt karsinomlarının kaynağıdır. Cilt dokusunun erişilebilirliği, noninvaziv intravital mikroskopi kullanarak bozulmamış hayvanlarda epitelyal ve dermal hücre davranışlarını izlemek için eşsiz bir fırsat sunar. Bununla birlikte, bu sofistike görüntüleme yaklaşımı, öncelikle, çoğu araştırmacı için giriş için önemli bir engel teşkil eden dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak elde edilmiştir. Bu çalışma, canlı transgenik farelerde kulak derisinin uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran, ters konfokal mikroskoplarla kullanıma uygun, özel olarak tasarlanmış, 3D baskılı bir mikroskop aşaması eki sunmaktadır. Ters mikroskop markasına ve tercih edilen modele uyacak şekilde özelleştirilebilen ve ek organ sistemlerini görüntülemek için uyarlanabilen bu çok yönlü buluşun, intravital mikroskopinin erişilebilirliğini önemli ölçüde artırarak daha büyük bilimsel araştırma topluluğu için paha biçilmez olacağına inanıyoruz. Bu teknolojik ilerleme, normal ve hastalık bağlamlarında canlı hücre dinamikleri hakkındaki anlayışımızı güçlendirmek için kritik öneme sahiptir.

Giriş

İntravital mikroskopi, hücre davranışlarının bozulmamış in vivo ortamlarında izlenmesini sağlayan güçlü bir araçtır. Bu benzersiz yöntem, akciğer¹, beyin², karaciğer³, meme bezi⁴, bağırsak⁵ ve cilt⁶ dahil olmak üzere karmaşık memeli organ sistemlerinin iç işleyişi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, bu yaklaşım, tümör gelişimi 7, yara iyileşmesi ^8,9, inflamasyon ¹⁰ ve diğer çeşitli patolojiler ....

Protokol

Bu araştırma, Emory Üniversitesi ve Atlanta Gazi İşleri Tıp Merkezi hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Canlı görüntüleme ekinin ters mikroskop aşamasına takılması

1. 3B boyutları ve tasarımı (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2A), bir 3B yazıcıyı ve polilaktik asidi (PLA) belirten .stl dosyalarını (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3) kullanarak eki oluşturun.
2. Ek parçayı (Şekil 2B,C) büyük ....

Tartışmalar

Bu çalışmada, inverted konfokal mikroskoplarda sağlam fare derisi epitelinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran yeni bir araç sunuyoruz. Bu buluş, en yaygın ve ucuz 3D yazdırılabilir malzeme olan PLA'dan yapılmıştır; Bu ek parça için tüm şirket içi 3D baskı maliyetleri 5 < tutarındadır. İki ayrı kesici uç parçası (Şekil 1, Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) ayar vidaları kullanılarak kolayca monte edilebili.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging