Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

Özet

Protokol, ters konfokal mikroskopi kullanarak intravital görüntülemeyi basitleştirmek için yeni bir araç sunar.

Özet

Normal ve anormal in vivo hücre davranışlarını anlamak, hastalığın başlamasını ve ilerlemesini engellemek için klinik müdahaleler geliştirmek için gereklidir. Bu nedenle, doku yapısının ve bileşiminin bozulmadan kaldığı hücre dinamiklerinin yerinde gözlemlenmesini kolaylaştıran görüntüleme yaklaşımlarını optimize etmek çok önemlidir. Epidermis, vücudun en dış bariyeri ve aynı zamanda en yaygın insan kanserlerinin, yani kutanöz cilt karsinomlarının kaynağıdır. Cilt dokusunun erişilebilirliği, noninvaziv intravital mikroskopi kullanarak bozulmamış hayvanlarda epitelyal ve dermal hücre davranışlarını izlemek için eşsiz bir fırsat sunar. Bununla birlikte, bu sofistike görüntüleme yaklaşımı, öncelikle, çoğu araştırmacı için giriş için önemli bir engel teşkil eden dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak elde edilmiştir. Bu çalışma, canlı transgenik farelerde kulak derisinin uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran, ters konfokal mikroskoplarla kullanıma uygun, özel olarak tasarlanmış, 3D baskılı bir mikroskop aşaması eki sunmaktadır. Ters mikroskop markasına ve tercih edilen modele uyacak şekilde özelleştirilebilen ve ek organ sistemlerini görüntülemek için uyarlanabilen bu çok yönlü buluşun, intravital mikroskopinin erişilebilirliğini önemli ölçüde artırarak daha büyük bilimsel araştırma topluluğu için paha biçilmez olacağına inanıyoruz. Bu teknolojik ilerleme, normal ve hastalık bağlamlarında canlı hücre dinamikleri hakkındaki anlayışımızı güçlendirmek için kritik öneme sahiptir.

Giriş

İntravital mikroskopi, hücre davranışlarının bozulmamış in vivo ortamlarında izlenmesini sağlayan güçlü bir araçtır. Bu benzersiz yöntem, akciğer¹, beyin², karaciğer³, meme bezi⁴, bağırsak⁵ ve cilt⁶ dahil olmak üzere karmaşık memeli organ sistemlerinin iç işleyişi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, bu yaklaşım, tümör gelişimi 7, yara iyileşmesi ^8,9, inflamasyon ¹⁰ ve diğer çeşitli patolojiler sırasında hücre davranış değişikliklerini ortaya çıkarmıştır. Bu çalışmada, sağlam fare derisinde canlı epitelyal ve stromal dinamikleri görüntülemek için intravital mikroskopinin erişilebilirliğini artırmaya odaklandık. Memeli derisindeki hücre davranışlarını anlamak, bu dokunun olağanüstü rejeneratif ve tümörjenik kapasitesi nedeniyle yüksek klinik öneme sahiptir.

Farelerde intravital görüntüleme, doku derinliklerinde >100 μm^11,12 yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlama yetenekleri nedeniyle öncelikle dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu cihazlar, daha kullanıcı dostu ve uygun maliyetli olan, kültürlenmiş hücreleri görüntüleme yeteneği sağlayan, görüntü elde etme sırasında tam karanlık gerektirmeyen ve genellikle daha güvenli olan ters konfokal mikroskopların çok yönlülüğünden ve daha genel erişilebilirliğinden yoksundur^13,14. Bu çalışmada, bu yaklaşımı ters konfokal mikroskoplar için uyarlayarak intravital görüntüleme erişilebilirliğini önemli ölçüde artıran yeni bir araç sunuyoruz.

Burada, ters konfokal bir mikroskopta fare kulağı derisinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştırmak için birkaç temel özelliği içeren 3D baskılı özel bir sahne eki tasarımı sunuyoruz (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5). Bu özel özellikler, görüntüleme sırasında yetişkin bir farenin tüm gövdesinin tamamen düz durmasına izin veren bir ofset objektif deliği içerir. Bu, fare vücut hareketlerinin görüntüleme üzerindeki titreşimsel girişimini en aza indirir ve genellikle intravital görüntüleme ile birleştirilen bir uygulama olan solunumu azaltmak için ketamin ve ksilazin uygulama ihtiyacını ortadan kaldırır⁶. Ek olarak, kesici uçtaki köşe parantezleri, farenin yüzüyle hizalanacak şekilde bir izofluran burun konisini doğru şekilde konumlandırır, metal bir kulak klipsi, fare kulağını özel olarak oluşturulmuş bir lamel diskine sabitler ve isteğe bağlı çıkarılabilir kapalı döngü biofeedback ısı plakası, uzun görüntüleme oturumları sırasında fare vücut sıcaklığını desteklemek için ek parçanın içinde aynı hizada bulunur. Fare kafasının ve kulağının düz durması için gerekli olan düz bir yüzey sağlayan özel lamel diski, bir makine atölyesinde, genel bir lamel içeren hücre kültürü kabının duvarlarının kaldırılmasıyla üretildi. Lamel diski ve özel sahne eki ile birlikte 40x silikon yağına daldırma lensinin (1,25 sayısal açıklık [N.A.], 0,3 mm çalışma mesafesi) kullanılması, kulak dermisinin derinliklerinde >50 μm derinliğinde yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar.

Bu yeni ters çevrilmiş mikroskop aşaması ekinin işlevselliğini test etmek için, canlı bir transgenik K14-H2B-mCherry¹⁵ yetişkin farenin kulağında 3 saatlik bir zaman seyri boyunca tüm epidermal epitel katmanlarını kapsayan z-yığınlarını yakaladık (bu fare serisindeki epitel çekirdekleri kırmızı bir floresan etiketi içerir) (Şekil 6A-A'). Ayrıca, canlı bir transgenik Pdgfra-rtTA^16'nın kulağında 3 saatlik bir zaman seyri boyunca cilt dermisi içindeki birkaç fibroblast tabakasını kapsayan z-yığınlarını yakaladık; pTRE-H2B-GFP¹⁷ yetişkin fare (bu fare serisindeki fibroblast çekirdekleri, doksisiklin indüksiyonunu takiben yeşil bir floresan etiketi içerir) (Şekil 6B-D'). Yüksek çözünürlüklü verilerimiz, x, y ve z düzlemlerinde sapma olmaması nedeniyle tutarlı bir kararlılık göstermekte ve böylece bu yeni intravital görüntüleme aracının ters mikroskoplarda kullanım için etkinliğini kanıtlamaktadır. Daha da önemlisi, bu 3D baskılı aşama ekinin boyutları, Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3'te açıklandığı gibi, herhangi bir ters çevrilmiş mikroskoba uyacak şekilde ayarlanabilir ve objektif açıklığın konumu, ilgilenilen belirli bir doku ve/veya hayvan modelinin görüntülenmesine daha iyi uyması için ek içindeki alternatif konumlara taşınabilir. Bu buluş, böylece bireysel laboratuvarları veya çekirdek tesis konfokal erişimi olan araştırmacıları, bu aracı benzersiz intravital görüntüleme ihtiyaçlarına uyarlamak için güçlendirebilir ve böylece çeşitli in vivo hücre biyolojisinin değerlendirilmesini kolaylaştırabilir.

Protokol

Bu araştırma, Emory Üniversitesi ve Atlanta Gazi İşleri Tıp Merkezi hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Canlı görüntüleme ekinin ters mikroskop aşamasına takılması

1. 3B boyutları ve tasarımı (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2A), bir 3B yazıcıyı ve polilaktik asidi (PLA) belirten .stl dosyalarını (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3) kullanarak eki oluşturun.
2. Ek parçayı (Şekil 2B,C) büyük mikroskop tablası oluğuna dikkatlice yerleştirin (Şekil 2C ve Şekil 3A). Kesici ucun her bir köşesinde bulunan dört vida deliği aracılığıyla kesici ucu sabitlemek için vidaları kullanın (Şekil 2B-C).
   NOT: Ek parça çift yönlüdür ve mikroskop aşamasının ve anestezi aparatının yönüne bağlı olarak 180° döndürülebilir.
3. Isı plakasını geçme tapasına tarafı aşağı bakacak şekilde kaydırın (Şekil 2D), böylece ünite, fiş portu s'nin altından geçecek şekilde alt geçme oluklarının üzerine uzanır.tage (Şekil 3B).
4. Ek parçadaki yivli dairesel açıklığı 40x silikon yağına daldırma objektifi ile hizalayın (Şekil 3C) ve objektifin ortasına silikon yağı uygulayın.
   1. Daha uzun sürelerde (>1 saat) görüntüleme yapıyorsanız, görüntüleme boyunca lamel / objektif arayüzünde kalacak bol miktarda yağ uygulayın. Lensin kenarlarına yağ dökülmesine izin vermeyin.
5. Yivli dairesel açıklık boyunca az miktarda vakumlu gres uygulamak için bir şırınga kullanın ve ek parçaya sızdırmaz hale getirmek için lamel diskini üstüne yerleştirin (Şekil 3D).
   NOT: Lamel diski, 35 mm x 10 mm'lik bir cam tabanlı hücre kültürü kabının (bir makine atölyesi tarafından gerçekleştirilir) duvarlarının çıkarılmasıyla oluşturulur.
6. 40x objektifi, yağ cam lamellerin altını öpene kadar yükseltin.

2. İzofluran konfigürasyonu ve fare hazırlığı

1. Düşük akışlı elektronik buharlaştırıcı bileşenlerini (anestezi odası, hortum, buharlaştırıcı, kömür kabı) burun konisinin ve bağlı borunun ek parçaya ulaşmasını sağlayacak şekilde konumlandırın (Şekil 3A).
   DİKKAT: İzofluran bir inhalasyon anestezisidir ve dökülmeleri önlemek ve insan maruziyetini en aza indirmek için dikkatli kullanılmalıdır.
2. Kullanmadan önce izofluran şişesinin ağırlığını ölçün ve kaydedin. Elektronik buharlaştırıcının kapağını izofluran şişesine takın.
3. Güç kablosunu elektronik buharlaştırıcıya bağlayın. Mavi burun konisi klipslerini kapatın ve odadan kömür kutusuna hava akışına izin vermek için beyaz indüksiyon odası klipslerini açın. Hava akışına izin vermek için makinenin sol tarafındaki kırmızı ortam havası kapağını çıkarın.
4. Sistemin 200 mL/dk (düşük akış) ve %2 izofluranda 5 dakika ısınmasına izin verin.
   NOT: Burun konisi ayarı seçilse de mavi burun konisi çizgisi kapalı, beyaz indüksiyon odası çizgisi açık kalmalıdır.
5. Sistem uygun şekilde dengelendikten sonra, kalan izofluranı odadan çıkarmak için hatları temizleyin.
6. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve Yüksek Akış'ı seçin. Hayvanın vücudunu ek parçanın üzerine yerleştirmeden önce tüm fare hazırlığını (yani epilasyon, topikal ilaç dağıtımı, göz merhemi uygulaması vb.) tamamlayın. Ayak parmağı kıstırma refleks yöntemini kullanarak farenin tamamen uyuşturulduğunu onaylayın.
   1. Bacak uzatılmışken, fiziksel hasara neden olmadan ayak parmağını sıkıca sıkıştırmak için bir tırnağınızı kullanın. Fare uyarana pozitif bir tepki gösterirse (ör., bacak çekilmesi, ayak seğirmesi, vb.), Herhangi bir reaksiyon gözlenene kadar oda içinde anestezi uygulamaya devam edin. Uygun şekilde uyuşturulduktan sonra, fare solunum hızı dakikada ~ 55-65 nefese kadar yavaşlamalıdır¹⁸.
7. Fare tamamen uyuşturulduğunda, izofluran iletimini durdurmak için tekrar Yüksek Akış'ı seçin. Açmadan önce hazneyi boşaltın ve burun konisinden izofluran vermek için klipsleri (mavi: açık; beyaz: kapalı) ayarlayın. İzofluran dağıtımına devam etmek için burun konisi fareye takılıyken Düşük Akış'ı seçin.
8. Ekli burun konisi ile izofluran boruyu, ek parçadaki köşe boru braketinden geçirin (Şekil 3A ve Şekil 5).

3. İntravital görüntüleme için ek parçaya fare yerleşimi

1. Isı plakasını kontrolöre (ekli bir anal prob içeren) takın, gücü açın ve plakanın 36 °C'ye ulaşmasını bekleyin (Şekil 4A).
2. Anestezi uygulanmış fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve ısı plakasının üzerine yerleştirin (Şekil 4B ve Şekil 5A). Farenin inhalan anestezi olmadan aktif olduğu süreyi en aza indirmek için hazneden yerleştirmeye hızlı bir şekilde transfer edin.
3. Burun konisini fareye sabitleyin (Şekil 4B,C ve Şekil 5). Gerekirse, burun konisinin açısını ve konumunu daha da sabitlemek için bant kullanın.
4. Anal probu takın ve fare vücut sıcaklığı ~36 °C'de sabit olana kadar kontrolör sıcaklığını ayarlayın (Şekil 4A,B). Fare uygun şekilde yerleştirildikten sonra, uygun vücut sıcaklığını daha fazla desteklemek için gerekirse ısıyı hapsetmek için plastik streç film kullanın (Şekil 4C).
5. Fareyi, kafa lamel diskiyle hizalanacak şekilde konumlandırın ve metal bir kulak klipsi (Şekil 5A,B) veya bant (Şekil 5C) kullanarak kulağı cam lamellerin ortasına sabitleyin.
   NOT: Metal kulak klipsinin kulak üzerindeki basıncı, klipsi ek parçaya sabitleyen vida gevşetilerek ayarlanabilir. Klips sıkma esnekliğini artırmak için metal bir yay eklenebilir.
   1. Kulak klipsi konumunu değiştirmek için cıvatayı 2.5 mm Alyen anahtarıyla sökün ve ikincil bölgeye aktarın (Şekil 2B,C). Kulak klipsini yeniden monte ederken, klipsi ek parçaya ve ardından rondelayı üstüne yerleştirin. Klipsi döndürmek için hafif bir kuvvetle klipsi güvenli bir şekilde sabitlemek için bir cıvata kullanın.
6. Hücreler odak noktasına gelene kadar objektif z konumlandırmasını ayarlayın (Şekil 6A,D). Deneysel hedeflere göre z-stack ve time-lapse parametrelerini ayarlayın ve görüntü alımına başlayın.
   NOT: Doğru kurulum sağlanırsa, fare kulağı en az 3 ardışık saat boyunca görüntülenebilir (Şekil 6A',D').
   1. Z-yığını sınırları ayarlandıktan sonra, foto ağartmayı en aza indirmek için hiçbir z-düzleminin aşırı doygun olmadığından emin olmak için lazer gücünü ve kazancını ayarlayın. z yığınının toplam kalınlığını, adım numaralarını (Nyquist örneklemesi önerilir) ve zaman aralıklarını kullanarak hızlandırılmış parametreleri belirleyin.
   2. Anestezi altında hayvan canlılığı, lazerle indüklenen fotoağartma/fototoksisite ve canlı görüntülemenin amacı (yani hücre bölünmesi dinamikleri, hücre-hücre etkileşimleri vb.) dahil olmak üzere birden fazla faktörü kullanarak görüntüleme parametrelerini (zaman aralıkları, toplam görüntüleme süresi vb.) belirleyin.

4. Görüntülemenin sonlandırılması

1. Su sirkülasyonlu ısı yastığını açın ve görüntü alımının sonlandırılmasından en az 35 dakika önce Sürekli Döngü ve 30 °C'ye ayarlayın.
2. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, izofluran iletimini durdurmak için elektronik buharlaştırıcıda Düşük Akış'ı seçin ve fareyi ambulatuvar olana kadar bir ısı yastığına taşıyın.
3. Uyandıktan sonra, tamamen yürüyene kadar bir ısı yastığı üzerinde tutmaya devam ederken fareyi transfer kabına geri getirin. Yanıt verene kadar ısı yastığı üzerindeyken fareyi sürekli olarak izleyin.
4. Elektronik buharlaştırıcıda, Menü Seç'e > Anestezik Kontrol'e tıklayın > Boş'a tıklayın. İzofluran şişesini sistemden çıkarın ve üreticinin kapağını şişeye geri yerleştirin.
5. İzofluran şişesinin ve kömür bidonunun ağırlığını ölçün ve ağırlıkları kütüğe girin. Kömür bidonunun ağırlığı temel ölçümün 50 g üzerinde olduğunda, bidonu atın ve yeni bir ünite ile değiştirin. İzofluranı kilitli kutuya geri koyun.
6. Lamel diskini çıkarın ve lens kağıdı ve lens solüsyonu ile silerek temizleyin. Yeniden kullanım için çizikleri önlemek için uygun şekilde saklayın.
7. Anestezi tüpünü insert braketinden çıkarın ve insert parçayı mikroskop aşamasından sökün.

Sonuçlar

Canlı görüntüleme ekinin ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop üzerine uygun şekilde monte edilmesi ve ek parçanın üzerine transgenik bir farenin uygun şekilde yönlendirilmesi, ≥1 saatlik bir süre boyunca floresan etiketli, canlı kulak dokusunun z-yığınlarının elde edilmesiyle doğrulanır ve x, y- ve z eksenlerinde minimum sapma kanıtı vardır. Görüntüler tutarlı aralıklarla yakalanmalıdır (aralık süresi biyolojik soruya, floresan sinyalinin gücüne vb. bağlı olacaktır), böylece hü...

Tartışmalar

Bu çalışmada, inverted konfokal mikroskoplarda sağlam fare derisi epitelinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran yeni bir araç sunuyoruz. Bu buluş, en yaygın ve ucuz 3D yazdırılabilir malzeme olan PLA'dan yapılmıştır; Bu ek parça için tüm şirket içi 3D baskı maliyetleri 5 < tutarındadır. İki ayrı kesici uç parçası (Şekil 1, Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) ayar vidaları kullanılarak kolayca monte edilebili...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging