倒立共焦点顕微鏡での上皮組織動態を長期モニタリングするための合理化された生体内イメージングアプローチ

要約

このプロトコルは、倒立共焦点顕微鏡を使用して生体内イメージングを簡素化する新しいツールを提供します。

要約

in vivo 細胞の正常な挙動と異常な挙動を理解することは、疾患の開始と進行を阻止するための臨床的介入を開発するために必要です。したがって、組織の構造と組成が乱れていない in situでの細胞動態の観察を容易にするイメージングアプローチを最適化することが重要です。表皮は体の最も外側のバリアであり、最も一般的なヒトの癌、すなわち皮膚癌の発生源でもあります。皮膚組織のアクセシビリティは、非侵襲的生体内顕微鏡を使用して、無傷の動物の上皮および真皮細胞の挙動をモニターするユニークな機会を提供します。それにもかかわらず、この高度なイメージングアプローチは、主に直立多光子顕微鏡を使用して達成されており、ほとんどの研究者にとって参入の大きな障壁となっています。この研究では、倒立共焦点顕微鏡での使用に適したカスタム設計の3Dプリント顕微鏡ステージインサートを提示し、生きたトランスジェニックマウスの耳の皮膚の長期的な生体内イメージングを合理化します。この汎用性の高い発明は、選択した倒立顕微鏡のブランドとモデルに合わせてカスタマイズでき、追加の臓器系のイメージングに適応できるため、生体内顕微鏡のアクセシビリティを大幅に向上させることで、より大きな科学研究コミュニティにとって非常に貴重であることが証明されると信じています。この技術的進歩は、正常および疾患における生細胞動態の理解を深めるために重要です。

概要

生体内顕微鏡は、in vivo環境での細胞挙動のモニタリングを可能にする強力なツールです。このユニークな手法は、肺¹、脳²、肝臓³、乳腺⁴、腸⁵、皮膚⁶など、複雑な哺乳類の器官系の内部構造に関する重要な洞察をもたらしました。さらに、このアプローチにより、^{腫瘍発生7}、創傷治癒^8,9、炎症¹⁰、およびその他の多様な病態における細胞の挙動変化が明らかになりました。この研究では、無傷のマウス皮膚の生きた上皮および間質の動態を画像化するための生体内顕微鏡検査のアクセシビリティを高めることに焦点を当てています。哺乳類の皮膚における細胞挙動を理解することは、この組織の顕著な再生能力と腫瘍形成能力のために臨床的に非常に重要です。

マウスの生体内イメージングは、組織深度>100μm11,12)で高解像度イメージングを提供する能力があるため、主に直立多光子顕微鏡を使用....

プロトコル

この研究は、エモリー大学とアトランタ退役軍人医療センターの動物のケアと使用のガイドラインに準拠して実施され、施設の動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 倒立顕微鏡ステージへのライブイメージングインサートの取り付け

1. 3D寸法とデザイン(図1および図2Aを参照)、3Dプリンター、およびポリ乳酸(PLA)を指定する.stlファイル(補足ファイル1、補足ファイル2、および補足ファイル3)を使用してインサートを作成します。
2. インサート(図2B、C)を顕微鏡ステージの大きな溝(図2Cおよび図3A)に慎重に配置します。ネジを使用して、チップの各コーナーにある4つのネジ穴でチップを固定します(図2B-C)。
   注:インサートは双方向で、顕微鏡ステージと麻酔装置の向きに応じて180....

ディスカッション

本研究では、倒立共焦点顕微鏡を用いて、無傷のマウス皮膚上皮を安定して長期間生体内イメージングすることを容易にする新しいツールを紹介します。この発明は、最も一般的で安価な3Dプリント可能な材料であるPLAで作られています。このインサートの社内3Dプリント費用は5<ドルです。2つの独立したインサートピース(図1、補足 ファイル1、 およ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging