倒立共焦点顕微鏡での上皮組織動態を長期モニタリングするための合理化された生体内イメージングアプローチ

要約

このプロトコルは、倒立共焦点顕微鏡を使用して生体内イメージングを簡素化する新しいツールを提供します。

要約

in vivo 細胞の正常な挙動と異常な挙動を理解することは、疾患の開始と進行を阻止するための臨床的介入を開発するために必要です。したがって、組織の構造と組成が乱れていない in situでの細胞動態の観察を容易にするイメージングアプローチを最適化することが重要です。表皮は体の最も外側のバリアであり、最も一般的なヒトの癌、すなわち皮膚癌の発生源でもあります。皮膚組織のアクセシビリティは、非侵襲的生体内顕微鏡を使用して、無傷の動物の上皮および真皮細胞の挙動をモニターするユニークな機会を提供します。それにもかかわらず、この高度なイメージングアプローチは、主に直立多光子顕微鏡を使用して達成されており、ほとんどの研究者にとって参入の大きな障壁となっています。この研究では、倒立共焦点顕微鏡での使用に適したカスタム設計の3Dプリント顕微鏡ステージインサートを提示し、生きたトランスジェニックマウスの耳の皮膚の長期的な生体内イメージングを合理化します。この汎用性の高い発明は、選択した倒立顕微鏡のブランドとモデルに合わせてカスタマイズでき、追加の臓器系のイメージングに適応できるため、生体内顕微鏡のアクセシビリティを大幅に向上させることで、より大きな科学研究コミュニティにとって非常に貴重であることが証明されると信じています。この技術的進歩は、正常および疾患における生細胞動態の理解を深めるために重要です。

概要

生体内顕微鏡は、in vivo環境での細胞挙動のモニタリングを可能にする強力なツールです。このユニークな手法は、肺¹、脳²、肝臓³、乳腺⁴、腸⁵、皮膚⁶など、複雑な哺乳類の器官系の内部構造に関する重要な洞察をもたらしました。さらに、このアプローチにより、^{腫瘍発生7}、創傷治癒^8,9、炎症¹⁰、およびその他の多様な病態における細胞の挙動変化が明らかになりました。この研究では、無傷のマウス皮膚の生きた上皮および間質の動態を画像化するための生体内顕微鏡検査のアクセシビリティを高めることに焦点を当てています。哺乳類の皮膚における細胞挙動を理解することは、この組織の顕著な再生能力と腫瘍形成能力のために臨床的に非常に重要です。

マウスの生体内イメージングは、組織深度>100μm11,12)で高解像度イメージングを提供する能力があるため、主に直立多光子顕微鏡を使用して行われてきました。それにもかかわらず、これらの機器は、よりユーザーフレンドリーで費用対効果が高く、培養細胞を画像化する機能を提供し、画像取得中に完全な暗闇を必要とせず、一般的に安全であり、他の注目すべき利点の中でも特に、倒立共焦点顕微鏡の主力の汎用性とより一般的なアクセス性を欠いています^13,14.本研究では、このアプローチを倒立共焦点顕微鏡に応用することで、生体内イメージングのアクセシビリティを大幅に向上させる新しいツールを紹介します。

ここでは、倒立共焦点顕微鏡でマウスの耳の皮膚を安定して長期間にわたって生体内イメージングするために、いくつかの重要な機能を組み込んだ3Dプリントによるカスタムステージインサートデザインを紹介します(図1、図2、図3、図4、図5)。 これらの特殊な機能には、イメージング中に成体マウスの全身を完全に平らにすることができるオフセット対物レンズ穴が含まれます。これにより、マウスの体の動きがイメージングに及ぼす振動干渉が最小限に抑えられ、呼吸を弱めるためにケタミンやキシラジンを投与する必要がなく^{なります6。}さらに、インサートのコーナーブラケットは、イソフルランノーズコーンをマウスの表面に合わせるように正しく配置し、金属製のイヤークリップはマウスの耳を特注のカバーガラスディスクに固定し、オプションの取り外し可能なクローズドループバイオフィードバックヒートプレートは、長時間のイメージングセッション中にマウスの体温をサポートするためにインサート内の高さにあります。マウスの頭と耳を平らにするために不可欠な平らな表面を提供するカスタムカバーガラスディスクは、一般的なカバーガラスを含む細胞培養皿の壁を取り外して機械工場で作成されました。40倍シリコーンオイル浸漬レンズ(開口数1.25、作動距離0.3mm)をカバーガラスディスクとカスタムステージインサートと組み合わせて使用することで、耳の真皮の深さ>50μmの高解像度画像を提供します。

この新しい倒立顕微鏡ステージインサートの機能を試験するために、生きたトランスジェニックK14-H2B-mCherry¹⁵成体マウス(このマウス系統の上皮核には赤色蛍光標識が含まれています)の耳で、すべての表皮上皮層にわたるzスタックを3時間にわたってキャプチャしました(図6A-A')。また、皮膚真皮内のいくつかの線維芽細胞層にまたがるzスタックを、生きたトランスジェニックPdgfra-rtTA¹⁶の耳で3時間の時間経過でキャプチャしました。pTRE-H2B-GFP¹⁷成体マウス(このマウス系統の線維芽細胞核は、ドキシサイクリン誘導後の緑色蛍光標識を含む)(図6B-D')。当社の高解像度データは、x、y、z平面のドリフトがないことによる一貫した安定性を示しており、倒立顕微鏡で使用するこの新しい生体内イメージングツールの有効性を証明しています。重要なことは、この3Dプリントされたステージインサートの寸法は、補足ファイル1、補足ファイル2、および補足ファイル3に記載されているように、任意の倒立顕微鏡に合うように調整することができ、対物レンズの開口部の位置をインサート内の別の場所に移動して、関心のある特定の組織および/または動物モデルのイメージングにより適したものにすることができることである。 したがって、本発明は、個々の研究室、またはコア施設の共焦点アクセスを持つ研究者が、このツールを独自の生体内イメージングニーズに適合させ、それによって多様なin vivo細胞生物学の評価を合理化することを可能にします。

プロトコル

この研究は、エモリー大学とアトランタ退役軍人医療センターの動物のケアと使用のガイドラインに準拠して実施され、施設の動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 倒立顕微鏡ステージへのライブイメージングインサートの取り付け

1. 3D寸法とデザイン(図1および図2Aを参照)、3Dプリンター、およびポリ乳酸(PLA)を指定する.stlファイル(補足ファイル1、補足ファイル2、および補足ファイル3)を使用してインサートを作成します。
2. インサート(図2B、C)を顕微鏡ステージの大きな溝(図2Cおよび図3A)に慎重に配置します。ネジを使用して、チップの各コーナーにある4つのネジ穴でチップを固定します(図2B-C)。
   注:インサートは双方向で、顕微鏡ステージと麻酔装置の向きに応じて180°回転させることができます。
3. ヒートプレートをチッププラグに横向きにして挿入し(図2D)、ユニットを下部のチップ溝の上に置き、プラグポートをステージの下まで通します(図3B)。
4. インサートの溝付き円形開口部を40倍シリコーンオイル浸対物レンズ(図3C)に合わせ、対物レンズの中心にシリコーンオイルを塗布します。
   1. より長い期間(>1時間)でイメージングする場合は、イメージング中、カバーガラス/対物レンズの界面に残留するオイルをたっぷりと塗布します。レンズの端に油がこぼれないようにしてください。
5. シリンジを使用して、溝のある円形の開口部に沿って少量の真空グリースを塗布し、カバーガラスディスクを上に置いてインサートに密封します(図3D)。
   注:カバーガラスディスクは、35 mm x 10 mmのガラス底の細胞培養皿の壁を取り外すことによって作成されます(機械工場で行います)。
6. オイルがガラスカバーガラスの底に接吻するまで、40倍の対物レンズを上げます。

2. イソフルランの構成とマウスの準備

1. 低流量電子気化器コンポーネント(麻酔チャンバー、チューブ、気化器、チャコールキャニスター)を配置して、ノーズコーンと付属のチューブがインサートに届くようにします(図3A)。
   注意: イソフルランは吸入麻酔薬であり、こぼれないように注意して取り扱う必要があり、人体への曝露を最小限に抑える必要があります。
2. 使用前にイソフルランボトルの重量を測定し、記録してください。電子気化器のキャップをイソフルランボトルに取り付けます。
3. 電源コードを電子気化器に接続します。青色のノーズコーンクリップを閉じ、白色のインダクションチャンバークリップを開いて、チャンバーからチャコールキャニスターに空気が流れるようにします。機械の左側から赤い周囲空気キャップを取り外して、空気の流れを確保します。
4. システムを 200 mL/分(低流量)および 2% イソフルランで 5 分間ウォームアップします。
   注意: ノーズコーン設定が選択されていますが、青いノーズコーンラインは閉じたままにし、白いインダクションチャンバーラインは開いたままにする必要があります。
5. システムが適切に平衡化されたら、ラインをパージしてチャンバーから残りのイソフルランを除去します。
6. 誘導チャンバーにマウスを置き、高流量を選択します。マウスの体をインサートの上に横たえる前に、すべてのマウスの準備(脱毛、局所薬物送達、眼軟膏の塗布など)を完了してください。つま先ピンチ反射法を使用してマウスに完全に麻酔がかけられていることを確認します。
   1. 脚を伸ばした状態で、爪を使ってつま先をしっかりとつまみ、物理的な損傷を与えないようにします。マウスが刺激に対して肯定的な反応(すなわち、.、脚の引っ込み、足のけいれんなど)を示した場合、反応が観察されなくなるまでチャンバー内で麻酔薬を投与し続けます。.適切に麻酔をかけると、マウスの呼吸数は毎分55~65回に遅くなるはずです¹⁸。
7. マウスに完全に麻酔をかけたら、再びHigh Flowを選択してイソフルラン送達を停止します。開く前にチャンバーをパージし、クリップ(青:開、白:閉)を調整して、ノーズコーンからイソフルランを送り出します。ノーズコーンをマウスに取り付けた状態でLow Flow(低流量)を選択すると、イソフルランの送達が継続されます。
8. 取り付けられたノーズコーンを取り付けたイソフルランチューブを、インサートのコーナーチューブブラケットに通します(図3A および 図5)。

3. 生体内イメージングのためのインサートへのマウスの配置

1. ヒートプレートをコントローラー(アナルプローブが取り付けられている)に差し込み、電源を入れて、プレートが36°Cに達するまで待ちます(図4A)。
2. 麻酔をかけたマウスを誘導チャンバーから取り出し、ヒートプレートの上に置きます(図4B および 図5A)。吸入麻酔なしでマウスが活動している時間を最小限に抑えるために、チャンバーから挿入までの移し替えを迅速に行います。
3. ノーズコーンをマウスに固定します(図4B、C、および図5)。必要に応じて、テープを使用してノーズコーンの角度と位置をさらに固定します。
4. 肛門プローブを挿入し、マウスの体温が~36°Cで安定するまでコントローラーの温度を調整します(図4A、B)。マウスを適切な位置に置いたら、必要に応じてラップで熱を閉じ込め、適切な体温をさらにサポートします(図4C)。
5. 頭がカバーガラスディスクに揃うようにマウスを配置し、金属製のイヤークリップ(図5A、B)またはテープ(図5C)を使用して、耳をガラスカバーガラスのカバーガラスの中央に固定します。
   注意: 耳に装着する金属製のイヤークリップの圧力は、クリップをインサートに固定しているネジを緩めることで調整できます。金属製のスプリングを追加することで、クリップの締め付けの柔軟性を高めることができます。
   1. イヤークリップの位置を変更するには、2.5mm六角レンチでボルトを緩め、セカンダリサイトに移します(図2B、C)。イヤークリップを組み立て直すときは、クリップをインサートに当ててから、ワッシャーを上に置きます。ボルトを使用してクリップをしっかりと固定し、わずかな力でクリップを回転させます。
6. 細胞が焦点位置内に収まるまで、対物レンズのz位置を調整します(図6A、D)。実験目標に応じてzスタックとタイムラプスのパラメータを設定し、画像取得を開始します。
   メモ: 正しいセットアップが達成されれば、マウスの耳を少なくとも3時間連続して画像化できます(図6A'、D')。
   1. Zスタックの境界を設定したら、レーザー出力とゲインを調整して、Z面が過飽和にならないようにして、光退色を最小限に抑えます。Zスタックの総厚さ、ステップ番号(ナイキストサンプリングを推奨)、および時間間隔を使用して、タイムラプスパラメータを決定します。
   2. 麻酔下での動物の生存率、レーザーによる光退色/光毒性、ライブイメージングの目標(細胞分裂動態、細胞間相互作用など)を含む複数の要因を使用して、イメージングパラメータ(時間間隔、総イメージング時間など)を決定します。

4. 撮像の中止

1. 水循環ヒートパッドをオンにし、連続 サイクル に設定し、 35°C で少なくとも30分間、画像取得を終了します。
2. イメージングが完了したら、電子気化器で 低流量 を選択してイソフルランの送達を停止し、歩行可能になるまでマウスをヒートパッドに移動します。
3. 目覚めたら、マウスを転送コンテナに戻し、完全に歩行可能になるまでヒートパッドを維持し続けます。マウスが反応するまで、ヒートパッドの上に置いたままマウスを一貫して監視します。
4. 電子気化器で、[Select Menu](メニューの選択)>[ Anesthetic Control](麻酔薬コントロール>空)をクリックします。イソフルランボトルをシステムから取り外し、メーカーのキャップをボトルに戻します。
5. イソフルランボトルとチャコールキャニスターの重量を測定し、重量をログに入力します。木炭キャニスターの重量がベースライン測定値より50 g重くなったら、キャニスターを廃棄し、新しいユニットと交換します。イソフルランをロックボックスに戻します。
6. カバーガラスディスクを取り外し、レンズペーパーとレンズ溶液できれいに拭きます。再利用のための傷を避けるために適切に保管してください。
7. インサートブラケットから麻酔チューブを取り外し、顕微鏡ステージからインサートのネジを外します。

結果

倒立共焦点顕微鏡上でのライブイメージングインサートの適切な組み立てと、インサート上のトランスジェニックマウスの適切な配向は、x、y、およびz軸のドリフトの証拠を最小限に抑えながら、時間経過≥1時間にわたって蛍光標識された生きた耳組織のzスタックを取得することによって検証されます。画像は一定の間隔で撮影し(間隔時間は生物学的な問題、蛍光シグナルの強さなどによ?...

ディスカッション

本研究では、倒立共焦点顕微鏡を用いて、無傷のマウス皮膚上皮を安定して長期間生体内イメージングすることを容易にする新しいツールを紹介します。この発明は、最も一般的で安価な3Dプリント可能な材料であるPLAで作られています。このインサートの社内3Dプリント費用は5<ドルです。2つの独立したインサートピース(図1、補足 ファイル1、 およ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging