Abordagem simplificada de imagem intravital para monitoramento de longo prazo da dinâmica do tecido epitelial em um microscópio confocal invertido

Resumo

O protocolo apresenta uma nova ferramenta para simplificar a obtenção de imagens intravitais usando microscopia confocal invertida.

Resumo

A compreensão do comportamento celular in vivo normal e aberrante é necessária para desenvolver intervenções clínicas que impeçam o início e a progressão da doença. Portanto, é fundamental otimizar as abordagens de imagem que facilitem a observação da dinâmica celular in situ, onde a estrutura e a composição do tecido permanecem inalteradas. A epiderme é a barreira mais externa do corpo, bem como a fonte dos cânceres humanos mais prevalentes, ou seja, os carcinomas cutâneos de pele. A acessibilidade do tecido cutâneo apresenta uma oportunidade única para monitorar o comportamento das células epiteliais e dérmicas em animais intactos usando microscopia intravital não invasiva. No entanto, essa abordagem sofisticada de imagem tem sido realizada principalmente usando microscópios multifótons verticais, que representam uma barreira significativa de entrada para a maioria dos investigadores. Este estudo apresenta um microscópio impresso em 3D com design personalizado, inserido em estágio de microscópio adequado para uso com microscópios confocais invertidos, simplificando a imagem intravital a longo prazo da pele da orelha em camundongos transgênicos vivos. Acreditamos que esta invenção versátil, que pode ser personalizada para se ajustar à marca e ao modelo de microscópio invertido de escolha e adaptada para sistemas de órgãos adicionais de imagem, será inestimável para a maior comunidade de pesquisa científica, melhorando significativamente a acessibilidade da microscopia intravital. Esse avanço tecnológico é fundamental para reforçar nossa compreensão da dinâmica de células vivas em contextos normais e de doenças.

Introdução

A microscopia intravital é uma poderosa ferramenta que permite o monitoramento do comportamento celular em seus ambientes in vivo não perturbados. Este método único forneceu informações importantes sobre o funcionamento interno de sistemas orgânicos complexos de mamíferos, incluindo o pulmão¹, cérebro², fígado³, glândula mamária⁴, intestino⁵ e pele⁶. Além disso, essa abordagem tem revelado alterações comportamentais celulares durante o desenvolvimento^tumoral7, cicatrização de^f....

Protocolo

Esta pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes de cuidados e uso de animais da Emory University e Atlanta Veterans Affairs Medical Center e foi aprovada pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

1. Instalação da inserção de imagem ao vivo no estágio do microscópio invertido

1. Construa a inserção usando arquivos .stl (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3) especificando as dimensões e o design 3D (consulte a Figura 1 e a Figura 2A), uma impressora 3D e ácido....

Discussão

Neste estudo, apresentamos uma nova ferramenta que facilita imagens intravitais estáveis e de longo prazo de epitélios intactos da pele de camundongos em microscópios confocais invertidos. Esta invenção é feita de PLA, que é o material mais comum e barato imprimível em 3D; todos os custos internos de impressão 3D para esta inserção totalizam < $5. As duas peças de inserção separadas (Figura 1, Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2) pode.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging