Abordagem simplificada de imagem intravital para monitoramento de longo prazo da dinâmica do tecido epitelial em um microscópio confocal invertido

Resumo

O protocolo apresenta uma nova ferramenta para simplificar a obtenção de imagens intravitais usando microscopia confocal invertida.

Resumo

A compreensão do comportamento celular in vivo normal e aberrante é necessária para desenvolver intervenções clínicas que impeçam o início e a progressão da doença. Portanto, é fundamental otimizar as abordagens de imagem que facilitem a observação da dinâmica celular in situ, onde a estrutura e a composição do tecido permanecem inalteradas. A epiderme é a barreira mais externa do corpo, bem como a fonte dos cânceres humanos mais prevalentes, ou seja, os carcinomas cutâneos de pele. A acessibilidade do tecido cutâneo apresenta uma oportunidade única para monitorar o comportamento das células epiteliais e dérmicas em animais intactos usando microscopia intravital não invasiva. No entanto, essa abordagem sofisticada de imagem tem sido realizada principalmente usando microscópios multifótons verticais, que representam uma barreira significativa de entrada para a maioria dos investigadores. Este estudo apresenta um microscópio impresso em 3D com design personalizado, inserido em estágio de microscópio adequado para uso com microscópios confocais invertidos, simplificando a imagem intravital a longo prazo da pele da orelha em camundongos transgênicos vivos. Acreditamos que esta invenção versátil, que pode ser personalizada para se ajustar à marca e ao modelo de microscópio invertido de escolha e adaptada para sistemas de órgãos adicionais de imagem, será inestimável para a maior comunidade de pesquisa científica, melhorando significativamente a acessibilidade da microscopia intravital. Esse avanço tecnológico é fundamental para reforçar nossa compreensão da dinâmica de células vivas em contextos normais e de doenças.

Introdução

A microscopia intravital é uma poderosa ferramenta que permite o monitoramento do comportamento celular em seus ambientes in vivo não perturbados. Este método único forneceu informações importantes sobre o funcionamento interno de sistemas orgânicos complexos de mamíferos, incluindo o pulmão¹, cérebro², fígado³, glândula mamária⁴, intestino⁵ e pele⁶. Além disso, essa abordagem tem revelado alterações comportamentais celulares durante o desenvolvimento^tumoral7, cicatrização de^{feridas8,9, inflamação10} e outras diversas patologias in situ. Neste estudo, nos concentramos em melhorar a acessibilidade da microscopia intravital para obter imagens da dinâmica epitelial e estromal viva em pele intacta de camundongos. A compreensão do comportamento celular na pele de mamíferos é de grande importância clínica devido à notável capacidade regenerativa e tumorigênica deste tecido.

A imagem intravital em camundongos tem sido realizada principalmente usando microscópios multifótons verticais devido à sua capacidade de fornecer imagens de alta resolução em profundidades teciduais >100 μm^11,12. No entanto, esses instrumentos carecem da versatilidade e acessibilidade mais geral dos microscópios confocais invertidos, que são mais fáceis de usar e econômicos, fornecem a capacidade de obter imagens de células cultivadas, não requerem escuridão completa durante a aquisição das imagens e geralmente são mais seguros, entre outras vantagens notáveis^13,14. Neste trabalho, apresentamos uma nova ferramenta que melhora significativamente a acessibilidade de imagens intravitais, adaptando essa abordagem para microscópios confocais invertidos.

Aqui, apresentamos um design de inserção de estágio personalizado impresso em 3D que incorpora várias características importantes para facilitar imagens intravitais estáveis e de longo prazo da pele da orelha de camundongos em um microscópio confocal invertido (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5). Esses recursos especializados incluem um orifício objetivo deslocado que permite que o corpo inteiro de um mouse adulto fique totalmente plano durante a aquisição de imagens. Isso minimiza a interferência vibracional dos movimentos do corpo de camundongos nas imagens e elimina a necessidade de administrar cetamina e xilazina para atenuar a respiração, uma prática frequentemente associada a imagens intravitais⁶. Além disso, os suportes de canto na pastilha posicionam corretamente um cone nasal de isoflurano para se alinhar com a face do mouse, um clipe de orelha de metal imobiliza a orelha do mouse para um disco de deslizamento de capa personalizado e uma placa de calor de biofeedback de circuito fechado destacável opcional fica nivelada dentro da inserção para suportar a temperatura corporal do mouse durante longas sessões de imagem. O disco de deslizamento de capa personalizado, que fornece uma superfície plana essencial para a cabeça e a orelha do rato ficarem planas, foi gerado em uma oficina de máquinas removendo as paredes de um prato genérico de cultura celular contendo lamínula. O uso de uma lente de imersão em óleo de silicone de 40x (abertura numérica de 1,25 [N.A.], distância de trabalho de 0,3 mm) em conjunto com o disco de deslizamento de cobertura e inserção de estágio personalizada fornece imagens de alta resolução >50 μm de profundidade na derme da orelha.

Para testar a funcionalidade desta nova inserção de estágio de microscópio invertido, capturamos pilhas z abrangendo todas as camadas epiteliais epidérmicas ao longo de um curso de tempo de 3 h na orelha de um camundongo adulto vivo transgênico K14-H2B-mCherry¹⁵ (núcleos epiteliais nesta linhagem de camundongo contêm uma etiqueta fluorescente vermelha) (Figura 6A-A'). Também capturamos pilhas-z abrangendo várias camadas de fibroblastos dentro da derme da pele durante um curso de tempo de 3 h na orelha de um Pdgfra-rtTA transgênico vivo¹⁶; Camundongos adultos pTRE-H2B-GFP¹⁷ (núcleos de fibroblastos nesta linhagem de camundongos contêm um rótulo fluorescente verde após indução de doxiciclina) (Figura 6B-D'). Nossos dados de alta resolução demonstram estabilidade consistente pela falta de deriva nos planos x, y e z, comprovando a eficácia desta nova ferramenta de imagem intravital para uso em microscópios invertidos. É importante ressaltar que as dimensões dessa inserção de estágio impressa em 3D podem ser ajustadas, conforme descrito em Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3, para caber em qualquer microscópio invertido, e o posicionamento da abertura objetiva pode ser movido para locais alternativos dentro da pastilha para melhor se adequar à imagem de um determinado tecido e/ou modelo animal de interesse. Esta invenção pode, assim, capacitar laboratórios individuais, ou investigadores com acesso confocal de instalações centrais, para adaptar esta ferramenta para suas necessidades únicas de imagem intravital, simplificando assim a avaliação de biologia celular in vivo diversa.

Protocolo

Esta pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes de cuidados e uso de animais da Emory University e Atlanta Veterans Affairs Medical Center e foi aprovada pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

1. Instalação da inserção de imagem ao vivo no estágio do microscópio invertido

1. Construa a inserção usando arquivos .stl (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3) especificando as dimensões e o design 3D (consulte a Figura 1 e a Figura 2A), uma impressora 3D e ácido polilático (PLA).
2. Coloque cuidadosamente a pastilha (Figura 2B,C) no sulco do estágio do microscópio grande (Figura 2C e Figura 3A). Use parafusos para fixar a pastilha através de quatro orifícios de parafusos localizados em cada canto da pastilha (Figura 2B-C).
   NOTA: A inserção é bidirecional e pode ser girada 180° dependendo da orientação do estágio do microscópio e do aparelho de anestesia.
3. Deslize a placa de calor para o plugue de inserção de lado para baixo (Figura 2D) de modo que a unidade fique sobre os sulcos de inserção inferiores com a porta do plugue passando por baixo do estágio (Figura 3B).
4. Alinhe a abertura circular ranhurada na pastilha com uma objetiva de imersão em óleo de silicone 40x (Figura 3C) e aplique óleo de silicone no centro da objetiva.
   1. Se a imagem for feita por períodos de tempo mais longos (>1 h), aplique um generoso pedaço de óleo que persistirá na interface coverslip/objetiva durante toda a imagem. Não permita que o óleo se derrame sobre as bordas da lente.
5. Use uma seringa para aplicar uma pequena quantidade de graxa a vácuo ao longo da abertura circular ranhurada e coloque o disco deslizante sobre a tampa para selar a pastilha (Figura 3D).
   NOTA: O disco de deslizamento de cobertura é criado removendo as paredes de uma placa de cultura de células com fundo de vidro de 35 mm x 10 mm (realizada por uma oficina mecânica).
6. Levante a objetiva de 40x até que o óleo beije o fundo da tampa de vidro.

2. Configuração do isoflurano e preparação do mouse

1. Posicione os componentes do vaporizador eletrônico de baixo fluxo (câmara de anestesia, tubulação, vaporizador, vasilhame de carvão) para permitir que o cone nasal e a tubulação acoplada alcancem a inserção (Figura 3A).
   CUIDADO: O isoflurano é um anestésico inalatório e deve ser manuseado com cuidado para evitar derramamentos e minimizar a exposição humana.
2. Medir o peso do frasco de isoflurano antes da utilização e registar. Fixe a tampa do vaporizador eletrônico ao frasco de isoflurano.
3. Conecte o cabo de alimentação ao vaporizador eletrônico. Feche os clipes do cone do nariz azul e abra os clipes brancos da câmara de indução para permitir o fluxo de ar através da câmara para o recipiente de carvão. Remova a tampa de ar ambiente vermelha do lado esquerdo da máquina para permitir o fluxo de ar.
4. Deixar o sistema aquecer por 5 min a 200 mL/min (fluxo baixo) e isoflurano a 2%.
   NOTA: Embora a configuração do cone do nariz esteja selecionada, a linha do cone do nariz azul deve permanecer fechada e a linha da câmara de indução branca deve permanecer aberta.
5. Uma vez que o sistema esteja devidamente equilibrado, purge as linhas para remover o isoflurano restante da câmara.
6. Coloque o mouse na câmara de indução e selecione Alto fluxo. Complete toda a preparação do rato (ou seja, depilação, entrega tópica de drogas, aplicação de pomada ocular, etc.) antes de colocar o corpo do animal sobre a inserção. Confirme se o mouse está totalmente anestesiado usando o método do reflexo de pinça dos dedos.
   1. Com a perna estendida, use uma unha para apertar firmemente o dedo do pé sem causar danos físicos. Se o camundongo apresentar uma reação positiva ao estímulo (i.e., retração da perna, contração do pé, etc.), continue administrando anestésico dentro da câmara até que nenhuma reação seja observada. Uma vez adequadamente anestesiado, a frequência respiratória do camundongo deve diminuir para ~55-65 respirações por minuto¹⁸.
7. Quando o mouse estiver totalmente anestesiado, selecione Alto fluxo novamente para interromper a administração de isoflurano. Limpe a câmara antes de abrir e ajuste os clipes (azul: aberto; branco: fechado) para entregar isoflurano através do cone nasal. Selecione Baixo fluxo enquanto o cone do nariz está conectado ao mouse para continuar a administração de isoflurano.
8. Tubo de rosca de isoflurano com o cone nasal acoplado através do suporte de tubo de canto no inserto (Figura 3A e Figura 5).

3. Posicionamento do mouse na inserção para aquisição de imagens intravitais

1. Conecte a placa de calor ao controlador (contendo uma sonda anal conectada), ligue e deixe a placa atingir 36 °C (Figura 4A).
2. Remova o camundongo anestesiado da câmara de indução e coloque-o sobre a placa de calor (Figura 4B e Figura 5A). Realize a transferência da câmara para inserir rapidamente para minimizar o tempo em que o mouse fica ativo sem anestesia inalante.
3. Fixe o cone nasal no mouse (Figura 4B,C e Figura 5). Se necessário, use fita adesiva para fixar ainda mais o ângulo e o posicionamento do cone nasal.
4. Insira a sonda anal e ajuste a temperatura do controlador até que a temperatura do corpo do mouse esteja estável em ~36 °C (Figura 4A,B). Depois que o mouse estiver posicionado corretamente, use filme plástico aderente para reter o calor, se necessário, para suportar ainda mais a temperatura corporal apropriada (Figura 4C).
5. Posicione o mouse de forma que a cabeça fique alinhada com o disco deslizante e imobilize a orelha no centro da lamínula de vidro usando um clipe auricular de metal (Figura 5A,B) ou fita adesiva (Figura 5C).
   NOTA: A pressão do clipe auricular de metal na orelha pode ser ajustada soltando o parafuso que prende o clipe à inserção. Uma mola de metal pode ser adicionada para maior flexibilidade de aperto do grampo.
   1. Para alterar a localização do clipe auricular, desaparafuse o parafuso com uma chave Allen de 2,5 mm e transfira para o local secundário (Figura 2B,C). Ao remontar o clipe auricular, coloque-o contra a pastilha, seguido da arruela por cima. Use um parafuso para prender o clipe com segurança com leve força para girar o clipe.
6. Ajustar o posicionamento z da objetiva até que as células estejam dentro do ponto focal (Figura 6A,D). Defina os parâmetros z-stack e time-lapse de acordo com os objetivos experimentais e inicie a aquisição da imagem.
   NOTA: Se a configuração correta for obtida, a orelha do mouse pode ser fotografada por pelo menos 3 h consecutivas (Figura 6A',D').
   1. Uma vez que os limites da pilha z estejam definidos, ajuste a potência e o ganho do laser para garantir que nenhum plano z esteja saturado demais para minimizar o fotoclareamento. Determine os parâmetros de lapso de tempo usando a espessura total da pilha z, números de passo (amostragem de Nyquist recomendada) e intervalos de tempo.
   2. Determine os parâmetros de imagem (intervalos de tempo, tempo total de imagem, etc.) usando múltiplos fatores, incluindo viabilidade animal sob anestesia, fotoclareamento/fototoxicidade induzida por laser e o objetivo de imagens ao vivo (ou seja, dinâmica de divisão celular, interações célula-célula, etc.).

4. Término da imagem

1. Ligue a almofada térmica circulante de água e ajuste para Ciclo Contínuo e 35 °C por pelo menos 30 minutos antes do término da aquisição da imagem.
2. Após a conclusão da imagem, selecione Baixo fluxo no vaporizador eletrônico para interromper a administração de isoflurano e mova o mouse para uma almofada térmica até o deambulação.
3. Uma vez acordado, mova o mouse de volta para o recipiente de transferência enquanto continua a manter em uma almofada térmica até que seja totalmente deambulado. Monitore consistentemente o mouse enquanto estiver na almofada térmica até que ele responda.
4. No vaporizador eletrônico, clique em Selecionar menu > Controle anestésico > Vazio. Retire o frasco de isoflurano do sistema e coloque a tampa do fabricante de volta no frasco.
5. Meça o peso do frasco de isoflurano e do botijão de carvão e insira os pesos no log. Uma vez que o botijão de carvão pese 50 g sobre a medição inicial, elimine o botijão e substitua-o por uma nova unidade. Devolva o isoflurano ao cofre.
6. Remova o disco de deslizamento da tampa e limpe com papel de lente e solução de lente. Armazenar corretamente para evitar riscos para reutilização.
7. Remova a tubulação de anestesia do suporte de inserção e desaparafuse a inserção do estágio do microscópio.

Resultados

A montagem adequada da inserção de imagem ao vivo em um microscópio confocal invertido e a orientação apropriada de um camundongo transgênico sobre a inserção são validadas pela aquisição de pilhas z de tecido auditivo vivo marcado fluorescentemente ao longo de um curso de tempo ≥1 h com evidência mínima de deriva nos eixos x, y e z. As imagens devem ser capturadas em intervalos consistentes (o tempo de intervalo dependerá da questão biológica, da força do sinal de fluorescência, etc.) para que a din?...

Discussão

Neste estudo, apresentamos uma nova ferramenta que facilita imagens intravitais estáveis e de longo prazo de epitélios intactos da pele de camundongos em microscópios confocais invertidos. Esta invenção é feita de PLA, que é o material mais comum e barato imprimível em 3D; todos os custos internos de impressão 3D para esta inserção totalizam < $5. As duas peças de inserção separadas (Figura 1, Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2) pode...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging