Approccio semplificato di imaging intravitale per il monitoraggio a lungo termine della dinamica del tessuto epiteliale su un microscopio confocale invertito

Riepilogo

Il protocollo presenta un nuovo strumento per semplificare l'imaging intravitale utilizzando la microscopia confocale invertita.

Abstract

Comprendere i comportamenti cellulari normali e aberranti in vivo è necessario per sviluppare interventi clinici per contrastare l'inizio e la progressione della malattia. È quindi fondamentale ottimizzare gli approcci di imaging che facilitano l'osservazione della dinamica cellulare in situ, dove la struttura e la composizione del tessuto rimangono imperturbate. L'epidermide è la barriera più esterna del corpo, nonché la fonte dei tumori umani più diffusi, vale a dire i carcinomi cutanei cutanei. L'accessibilità del tessuto cutaneo rappresenta un'opportunità unica per monitorare i comportamenti delle cellule epiteliali e dermiche in animali intatti utilizzando la microscopia intravitale non invasiva. Tuttavia, questo sofisticato approccio di imaging è stato realizzato principalmente utilizzando microscopi multifotoni verticali, che rappresentano una barriera significativa per l'ingresso per la maggior parte dei ricercatori. Questo studio presenta un inserto per microscopio stampato in 3D progettato su misura adatto per l'uso con microscopi confocali invertiti, semplificando l'imaging intravitale a lungo termine della pelle dell'orecchio in topi transgenici vivi. Riteniamo che questa invenzione versatile, che può essere personalizzata per adattarsi alla marca e al modello di microscopio invertito scelto e adattata per visualizzare sistemi di organi aggiuntivi, si rivelerà preziosa per la più ampia comunità di ricerca scientifica migliorando significativamente l'accessibilità della microscopia intravitale. Questo progresso tecnologico è fondamentale per rafforzare la nostra comprensione delle dinamiche delle cellule vive in contesti normali e patologici.

Introduzione

La microscopia intravitale è un potente strumento che consente il monitoraggio dei comportamenti delle cellule nei loro ambienti imperturbati in vivo. Questo metodo unico ha fornito informazioni chiave sul funzionamento interno di complessi sistemi di organi dei mammiferi, tra cui il polmone¹, il cervello², il fegato³, la ghiandola mammaria⁴, l'intestino⁵ e la pelle⁶. Inoltre, questo approccio ha rivelato alterazioni comportamentali cellulari durante lo sviluppo del tumore⁷, la guarigione delle ferite^8,9, l'infiammazione¹⁰ e altre diverse patologie in situ. In questo studio, ci concentriamo sul miglioramento dell'accessibilità della microscopia intravitale per visualizzare le dinamiche epiteliali e stromali vive nella pelle intatta del topo. La comprensione dei comportamenti cellulari nella pelle dei mammiferi è di grande importanza clinica a causa della notevole capacità rigenerativa e tumorigenica di questo tessuto.

L'imaging intravitale nei topi è stato eseguito principalmente utilizzando microscopi multifotoni verticali grazie alla loro capacità di fornire immagini ad alta risoluzione a profondità tissutali >100 μm^11,12. Tuttavia, questi strumenti non hanno la versatilità e l'accessibilità più generale dei microscopi confocali invertiti, che sono più facili da usare ed economici, offrono la capacità di visualizzare cellule in coltura, non richiedono un'oscurità completa durante l'acquisizione delle immagini e sono generalmente più sicuri, tra gli altri notevoli vantaggi^13,14. In questo studio, presentiamo un nuovo strumento che migliora significativamente l'accessibilità all'imaging intravitale adattando questo approccio ai microscopi confocali invertiti.

Qui, presentiamo un design dell'inserto del palco personalizzato stampato in 3D che incorpora diverse caratteristiche chiave per facilitare l'imaging intravitale stabile e a lungo termine della pelle dell'orecchio del topo su un microscopio confocale invertito (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5). Queste caratteristiche specializzate includono un foro dell'obiettivo sfalsato che consente all'intero corpo di un topo adulto di essere completamente piatto durante l'imaging. Ciò riduce al minimo l'interferenza vibrazionale dei movimenti del corpo del topo sull'imaging ed elimina la necessità di somministrare ketamina e xilazina per smorzare la respirazione, una pratica spesso abbinata all'imaging intravitale⁶. Inoltre, le staffe angolari sull'inserto posizionano correttamente un cono nasale in isoflurano per allinearlo con la faccia del mouse, una clip auricolare in metallo immobilizza l'orecchio del mouse su un disco coprioggetti costruito su misura e una piastra riscaldante biofeedback a circuito chiuso staccabile opzionale si trova a filo all'interno dell'inserto per supportare la temperatura corporea del mouse durante le lunghe sessioni di imaging. Il disco coprioggetto personalizzato, che fornisce una superficie piana essenziale per la testa e l'orecchio del topo, è stato generato in un'officina meccanica rimuovendo le pareti di un piatto di coltura cellulare contenente vetrino coprioggetti generico. L'uso di una lente a immersione in olio di silicone 40x (apertura numerica 1,25 [N.A.], distanza di lavoro 0,3 mm) in combinazione con il disco coprioggetti e l'inserto del tavolino personalizzato fornisce immagini ad alta risoluzione >50 μm di profondità nel derma dell'orecchio.

Per testare la funzionalità di questo nuovo inserto per microscopio invertito, abbiamo catturato z-stack che coprono tutti gli strati epiteliali epidermici in un corso di tempo di 3 ore nell'orecchio di un topo adulto transgenico vivo K14-H2B-mCherry¹⁵ (i nuclei epiteliali in questa linea murina contengono un'etichetta fluorescente rossa) (Figura 6A-A'). Abbiamo anche catturato z-stack che si estendono su diversi strati di fibroblasti all'interno del derma cutaneo in un corso di tempo di 3 ore nell'orecchio di un Pdgfra-rtTA¹⁶ transgenico vivo; pTRE-H2B-GFP¹⁷ topo adulto (i nuclei dei fibroblasti in questa linea murina contengono un'etichetta fluorescente verde dopo l'induzione della doxiciclina) (Figura 6B-D'). I nostri dati ad alta risoluzione dimostrano una stabilità costante grazie all'assenza di deriva nei piani x, y e z, dimostrando così l'efficacia di questo nuovo strumento di imaging intravitale per l'uso su microscopi invertiti. È importante sottolineare che le dimensioni di questo inserto per tavolino stampato in 3D possono essere regolate, come descritto in File supplementare 1, File supplementare 2 e File supplementare 3, per adattarsi a qualsiasi microscopio invertito e il posizionamento dell'apertura dell'obiettivo può essere spostato in posizioni alternative all'interno dell'inserto per adattarsi meglio all'imaging di un particolare tessuto e/o modello animale di interesse. Questa invenzione può quindi consentire ai singoli laboratori, o ai ricercatori con accesso confocale alla struttura principale, di adattare questo strumento alle loro esigenze uniche di imaging intravitale, semplificando così la valutazione di diverse biologia cellulari in vivo.

Protocollo

Questa ricerca è stata eseguita in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali della Emory University e dell'Atlanta Veterans Affairs Medical Center ed è stata approvata dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Installazione dell'inserto per imaging dal vivo sul tavolino del microscopio invertito

1. Costruire l'inserto utilizzando file .stl (File supplementare 1, File supplementare 2 e File supplementare 3) specificando le dimensioni e il design 3D (vedere la Figura 1 e la Figura 2A), una stampante 3D e l'acido polilattico (PLA).
2. Posizionare con cautela l'inserto (Figura 2B,C) nella grande scanalatura del tavolino del microscopio (Figura 2C e Figura 3A). Utilizzare le viti per fissare l'inserto tramite quattro fori per viti situati in ciascun angolo dell'inserto (Figura 2B-C).
   NOTA: L'inserto è bidirezionale e può essere ruotato di 180° a seconda dell'orientamento del tavolino del microscopio e dell'apparecchio per anestesia.
3. Far scorrere la piastra riscaldante nell'inserto con il lato rivolto verso il basso (Figura 2D) in modo che l'unità si trovi sopra le scanalature inferiori dell'inserto con la porta della spina che passa sotto il stage (Figura 3B).
4. Allineare l'apertura circolare scanalata nell'inserto con un obiettivo a immersione in olio di silicone 40x (Figura 3C) e applicare olio di silicone al centro dell'obiettivo.
   1. Se si esegue l'imaging per periodi di tempo più lunghi (>1 ora), applicare una generosa quantità di olio che persisterà sull'interfaccia vetrino coprioggetto/obiettivo durante l'imaging. Evitare che l'olio fuoriesca dai bordi dell'obiettivo.
5. Utilizzare una siringa per applicare una piccola quantità di grasso sottovuoto lungo l'apertura circolare scanalata e posizionare il disco coprioggetto sopra per sigillare l'inserto (Figura 3D).
   NOTA: Il disco coprioggetti viene creato rimuovendo le pareti di una piastra di coltura cellulare con fondo in vetro da 35 mm x 10 mm (eseguita da un'officina meccanica).
6. Alza l'obiettivo 40x finché l'olio non bacia il fondo del vetrino.

2. Configurazione dell'isoflurano e preparazione del mouse

1. Posizionare i componenti elettronici del vaporizzatore a basso flusso (camera di anestesia, tubo, vaporizzatore, contenitore di carbone) in modo che l'ogiva e il tubo collegato raggiungano l'inserto (Figura 3A).
   ATTENZIONE: L'isoflurano è un anestetico per inalazione e deve essere maneggiato con cura per evitare fuoriuscite e ridurre al minimo l'esposizione umana.
2. Misurare il peso del flacone di isoflurano prima dell'uso e registrare. Attacca il tappo del vaporizzatore elettronico al flacone di isoflurano.
3. Collegare il cavo di alimentazione al vaporizzatore elettronico. Chiudere le clip a cono blu e aprire le clip bianche della camera di induzione per consentire il flusso d'aria attraverso la camera nel contenitore del carbone. Rimuovere il cappello dell'aria ambiente rosso dal lato sinistro della macchina per consentire il flusso d'aria.
4. Lasciare che il sistema si riscaldi per 5 minuti a 200 ml/min (flusso basso) e isoflurano al 2%.
   NOTA: Sebbene sia selezionata l'impostazione del cono del naso, la linea del cono del naso blu deve rimanere chiusa e la linea della camera di induzione bianca deve rimanere aperta.
5. Una volta che il sistema è correttamente bilanciato, spurgare le linee per rimuovere l'isoflurano rimanente dalla camera.
6. Posizionare il mouse nella camera di induzione e selezionare High Flow. Completare tutta la preparazione del topo (ad esempio, depilazione, somministrazione di farmaci topici, applicazione di unguento per gli occhi, ecc.) prima di posizionare il corpo dell'animale sopra l'inserto. Verificare che il mouse sia completamente anestetizzato utilizzando il metodo del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
   1. Con la gamba estesa, usa un'unghia per pizzicare saldamente la punta del piede senza causare danni fisici. Se il topo mostra una reazione positiva allo stimolo (ad esempio, retrazione delle gambe, contrazione del piede, ecc.), continuare a somministrare l'anestetico all'interno della camera fino a quando non si osserva alcuna reazione. Una volta anestetizzato in modo appropriato, la frequenza respiratoria del topo dovrebbe rallentare a ~55-65 respiri al minuto¹⁸.
7. Quando il mouse è completamente anestetizzato, selezionare di nuovo High Flow per interrompere l'erogazione di isoflurano. Spurgare la camera prima di aprirla e regolare le clip (blu: aperte; bianche: chiuse) per erogare l'isoflurano attraverso l'ogiva. Selezionare Flusso basso mentre l'ogiva è attaccata al mouse per continuare l'erogazione dell'isoflurano.
8. Infilare il tubo in isoflurano con il cono del naso attaccato attraverso la staffa angolare del tubo sull'inserto (Figura 3A e Figura 5).

3. Posizionamento del topo sull'inserto per l'imaging intravitale

1. Collegare la piastra riscaldante al controller (contenente una sonda anale collegata), accenderla e lasciare che la piastra raggiunga i 36 °C (Figura 4A).
2. Rimuovere il topo anestetizzato dalla camera di induzione e posizionarlo sulla piastra riscaldante (Figura 4B e Figura 5A). Eseguire rapidamente il trasferimento dalla camera all'inserimento per ridurre al minimo il tempo di attività del topo senza anestesia inalante.
3. Fissare l'ogiva sul mouse (Figura 4B, C e Figura 5). Se necessario, utilizzare del nastro adesivo per fissare ulteriormente l'angolo e il posizionamento dell'ogiva.
4. Inserire la sonda anale e regolare la temperatura del controller fino a quando la temperatura corporea del mouse non è stabile a ~36 °C (Figura 4A,B). Dopo che il mouse è stato posizionato correttamente, utilizzare una pellicola trasparente di plastica per intrappolare il calore, se necessario, per supportare ulteriormente la temperatura corporea appropriata (Figura 4C).
5. Posizionate il mouse in modo che la testa sia allineata con il disco coprioggetto e immobilizzate l'orecchio al centro del vetrino coprioggetti utilizzando una clip auricolare in metallo (Figura 5A,B) o del nastro adesivo (Figura 5C).
   NOTA: La pressione della clip auricolare in metallo sull'orecchio può essere regolata allentando la vite che fissa la clip all'inserto. È possibile aggiungere una molla metallica per una maggiore flessibilità di serraggio della clip.
   1. Per modificare la posizione della clip auricolare, svitare il bullone con una chiave a brugola da 2.5 mm e trasferirlo nel sito secondario (Figura 2B,C). Quando si rimonta la clip per l'orecchio, posizionare la clip contro l'inserto, seguita dalla rondella sulla parte superiore. Utilizzare un bullone per fissare saldamente la clip con una leggera forza per ruotare la clip.
6. Regolare il posizionamento z dell'obiettivo fino a quando le celle non si trovano all'interno della posizione focale (Figura 6A,D). Impostare i parametri z-stack e time-lapse in base agli obiettivi sperimentali e avviare l'acquisizione delle immagini.
   NOTA: Se si ottiene la configurazione corretta, l'orecchio del mouse può essere ripreso per almeno 3 ore consecutive (Figura 6A',D').
   1. Una volta impostati i limiti dello z-stack, regolare la potenza e il guadagno del laser per assicurarsi che nessun piano z sia sovrasaturato per ridurre al minimo il fotosbiancamento. Determinare i parametri time-lapse utilizzando lo spessore totale dello z-stack, i numeri dei passi (campionamento di Nyquist consigliato) e gli intervalli di tempo.
   2. Determinare i parametri di imaging (intervalli di tempo, tempo totale di imaging, ecc.) utilizzando più fattori, tra cui la vitalità animale in anestesia, il fotosbiancamento/fototossicità indotto dal laser e l'obiettivo dell'imaging dal vivo (ad esempio, dinamiche di divisione cellulare, interazioni cellula-cellula, ecc.).

4. Cessazione dell'imaging

1. Accendere il termoforo a circolazione d'acqua e impostarlo su Ciclo continuo e 35 °C per almeno 30 minuti prima di terminare l'acquisizione dell'immagine.
2. Al termine dell'imaging, selezionare Low Flow sul vaporizzatore elettronico per interrompere l'erogazione di isoflurano e spostare il mouse su un termoforo fino a quando non si deambula.
3. Una volta sveglio, sposta il mouse nel contenitore di trasferimento continuando a tenerlo su un termoforo fino a quando non è completamente deambulante. Monitora costantemente il mouse mentre sei sul termoforo finché non è reattivo.
4. Sul vaporizzatore elettronico, fai clic su Seleziona menu > Controllo anestetico > Vuoto. Rimuovere il flacone di isoflurano dal sistema e riposizionare il tappo del produttore sul flacone.
5. Misurare il peso della bombola di isoflurano e del contenitore del carbone e inserire i pesi nel registro. Una volta che il contenitore del carbone pesa 50 g oltre la misurazione di base, smaltire il contenitore e sostituirlo con una nuova unità. Rimettere l'isoflurano nella cassetta di sicurezza.
6. Rimuovere il disco coprioggetti e pulirlo con carta per lenti e soluzione per lenti. Conservare correttamente per evitare graffi per il riutilizzo.
7. Rimuovere il tubo per anestesia dalla staffa dell'inserto e svitare l'inserto dal tavolino del microscopio.

Risultati

Il corretto assemblaggio dell'inserto di imaging dal vivo su un microscopio confocale invertito e l'orientamento appropriato di un topo transgenico in cima all'inserto sono convalidati acquisendo pile z di tessuto dell'orecchio vivo marcato con fluorescenza in un corso di tempo ≥1 ora con evidenza minima di deriva negli assi x, y e z. Le immagini devono essere acquisite a intervalli coerenti (il tempo di intervallo dipenderà dalla domanda biologica, dalla forza del segnale di fluorescenza, ecc.) in modo che la dinamic...

Discussione

In questo studio, presentiamo un nuovo strumento che facilita l'imaging intravitale stabile e a lungo termine di epiteli cutanei di topo intatti su microscopi confocali invertiti. Questa invenzione è realizzata in PLA, che è il materiale stampabile in 3D più comune ed economico; tutti i costi di stampa 3D interni per questo inserto ammontano a < $ 5. I due pezzi separati dell'inserto (Figura 1, File supplementare 1 e File supplementare 2) possono essere f...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging