Approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé

Résumé

Le protocole présente un nouvel outil pour simplifier l’imagerie intravitale à l’aide de la microscopie confocale inversée.

Résumé

Comprendre les comportements normaux et aberrants des cellules in vivo est nécessaire pour développer des interventions cliniques visant à contrecarrer l’initiation et la progression de la maladie. Il est donc essentiel d’optimiser les approches d’imagerie qui facilitent l’observation de la dynamique cellulaire in situ, où la structure et la composition des tissus restent inchangées. L’épiderme est la barrière la plus externe de l’organisme, ainsi que la source des cancers humains les plus répandus, à savoir les carcinomes cutanés de la peau. L’accessibilité des tissus cutanés offre une occasion unique de surveiller les comportements des cellules épithéliales et dermiques chez les animaux intacts à l’aide de la microscopie intravitale non invasive. Néanmoins, cette approche d’imagerie sophistiquée a été principalement réalisée à l’aide de microscopes multiphotoniques verticaux, qui représentent une barrière importante à l’entrée pour la plupart des chercheurs. Cette étude présente un insert de platine de microscope conçu sur mesure, imprimé en 3D, adapté à une utilisation avec des microscopes confocaux inversés, rationalisant l’imagerie intravitale à long terme de la peau de l’oreille chez des souris transgéniques vivantes. Nous pensons que cette invention polyvalente, qui peut être personnalisée pour s’adapter à la marque et au modèle de microscope inversé de votre choix et adaptée à l’imagerie de systèmes d’organes supplémentaires, s’avérera inestimable pour l’ensemble de la communauté de la recherche scientifique en améliorant considérablement l’accessibilité de la microscopie intravitale. Cette avancée technologique est essentielle pour renforcer notre compréhension de la dynamique des cellules vivantes dans des contextes normaux et pathologiques.

Introduction

La microscopie intravitale est un outil puissant qui permet de surveiller les comportements cellulaires dans leurs environnements in vivo non perturbés. Cette méthode unique a fourni des informations clés sur le fonctionnement interne de systèmes d’organes complexes de mammifères, notamment le poumon¹, le cerveau², le foie³, la glande mammaire⁴, l’intestin⁵ et la peau⁶. De plus, cette approche a révélé des altérations du comportement cellulaire au cours du développement de la tumeur⁷, de la cicatrisation des plaies^8,9, de l’inflammation¹⁰ et d’autres pathologies diverses in situ. Dans cette étude, nous nous concentrons sur l’amélioration de l’accessibilité de la microscopie intravitale pour imager la dynamique épithéliale et stromale vivante dans la peau intacte de souris. La compréhension des comportements cellulaires de la peau des mammifères est d’une grande importance clinique en raison de la remarquable capacité de régénération et de tumoricité de ce tissu.

L’imagerie intravitale chez la souris a été principalement réalisée à l’aide de microscopes multiphotoniques verticaux en raison de leur capacité à fournir une imagerie à haute résolution à des profondeurs tissulaires >100 μm^11,12. Néanmoins, ces instruments n’ont pas la polyvalence et l’accessibilité plus générale des microscopes confocaux inversés, qui sont plus conviviaux et plus rentables, permettent d’imager des cellules en culture, ne nécessitent pas d’obscurité complète lors de l’acquisition d’images et sont généralement plus sûrs, entre autres avantages notables^13,14. Dans cette étude, nous présentons un nouvel outil qui améliore considérablement l’accessibilité de l’imagerie intravitale en adaptant cette approche aux microscopes confocaux inversés.

Ici, nous présentons une conception d’insert de platine personnalisée imprimée en 3D qui intègre plusieurs caractéristiques clés pour faciliter l’imagerie intravitale stable et à long terme de la peau de l’oreille de souris sur un microscope confocal inversé (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4 et Figure 5). Ces caractéristiques spécialisées comprennent un trou d’objectif décalé qui permet au corps entier d’une souris adulte de reposer entièrement à plat pendant l’imagerie. Cela minimise les interférences vibratoires des mouvements du corps de la souris sur l’imagerie et élimine le besoin d’administrer de la kétamine et de la xylazine pour atténuer la respiration, une pratique souvent associée à l’imagerie intravitale⁶. De plus, des supports d’angle sur l’insert positionnent correctement un cône nasal isoflurane pour qu’il s’aligne avec le visage de la souris, un clip d’oreille en métal immobilise l’oreille de la souris sur un disque de lamelle construit sur mesure, et une plaque chauffante de biofeedback en boucle fermée amovible en option affleure dans l’insert pour soutenir la température du corps de la souris pendant les longues sessions d’imagerie. Le disque de lamelles personnalisé, qui fournit une surface plane essentielle pour que la tête et l’oreille de la souris puissent être posées à plat, a été généré dans un atelier d’usinage en enlevant les parois d’une boîte de culture cellulaire générique contenant des lamelles. L’utilisation d’une lentille d’immersion dans l’huile de silicone 40x (ouverture numérique de 1,25 [N.A.], distance de travail de 0,3 mm) en conjonction avec le disque de lamelle et l’insert de platine personnalisé permet d’obtenir des images haute résolution à >50 μm de profondeur dans le derme de l’oreille.

Pour tester la fonctionnalité de ce nouvel insert de platine de microscope inversé, nous avons capturé des empilements z couvrant toutes les couches épithéliales épidermiques sur une période de 3 h dans l’oreille d’une souris adulte transgénique vivante K14-H2B-mCherry¹⁵ (les noyaux épithéliaux de cette lignée de souris contiennent une étiquette fluorescente rouge) (Figure 6A-A'). Nous avons également capturé des piles z couvrant plusieurs couches de fibroblastes dans le derme de la peau sur une période de 3 h dans l’oreille d’un Pdgfra-rtTA¹⁶ transgénique vivant ; pTRE-H2B-GFP¹⁷ souris adulte (les noyaux des fibroblastes de cette lignée de souris contiennent un marquage fluorescent vert après induction de la doxycycline) (Figure 6B-D'). Nos données à haute résolution démontrent une stabilité constante par l’absence de dérive dans les plans x, y et z, prouvant ainsi l’efficacité de ce nouvel outil d’imagerie intravitale pour une utilisation sur des microscopes inversés. Il est important de noter que les dimensions de cet insert de platine imprimé en 3D peuvent être ajustées, comme décrit dans les fichiers supplémentaires 1, 2 et 3, pour s’adapter à n’importe quel microscope inversé, et le positionnement de l’ouverture de l’objectif peut être déplacé vers d’autres emplacements dans l’insert pour mieux s’adapter à l’imagerie d’un tissu particulier et/ou d’un modèle animal d’intérêt. Cette invention peut ainsi permettre à des laboratoires individuels, ou à des chercheurs disposant d’un accès confocal à une installation centrale, d’adapter cet outil à leurs besoins uniques en matière d’imagerie intravitale, rationalisant ainsi l’évaluation de diverses biologies cellulaires in vivo.

Protocole

Cette recherche a été réalisée conformément aux directives de l’Université Emory et du centre médical des anciens combattants d’Atlanta sur les soins et l’utilisation des animaux et a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).

1. Installation de l’insert d’imagerie en direct sur la platine du microscope inversé

1. Construisez l’insert à l’aide de fichiers .stl (Fichier supplémentaire 1, Fichier supplémentaire 2 et Fichier supplémentaire 3) en spécifiant les dimensions et la conception 3D (voir Figure 1 et Figure 2A), une imprimante 3D et de l’acide polylactique (PLA).
2. Placez délicatement l’insert (Figure 2B,C) dans la grande rainure de la platine du microscope (Figure 2C et Figure 3A). Utilisez des vis pour fixer l’insert à l’aide de quatre trous de vis situés dans chaque coin de l’insert (Figure 2B-C).
   REMARQUE : L’insert est bidirectionnel et peut être tourné à 180° en fonction de l’orientation de la platine du microscope et de l’appareil d’anesthésie.
3. Faites glisser la plaque chauffante dans le bouchon d’insertion, côté vers le bas (Figure 2D) de manière à ce que l’appareil repose sur les rainures d’insertion inférieures, l’orifice de la fiche passant sous la platine (Figure 3B).
4. Alignez l’ouverture circulaire rainurée de l’insert avec un objectif d’immersion d’huile de silicone 40x (Figure 3C) et appliquez de l’huile de silicone au centre de l’objectif.
   1. Si l’imagerie s’étend sur des périodes plus longues (>1 h), appliquez une généreuse cuillerée d’huile qui persistera à l’interface lamelle/objectif tout au long de l’imagerie. Ne laissez pas l’huile se répandre sur les bords de l’objectif.
5. À l’aide d’une seringue, appliquez une petite quantité de graisse sous vide le long de l’ouverture circulaire rainurée et posez le disque de lamelle sur le dessus pour sceller l’insert (Figure 3D).
   REMARQUE : Le disque de lamelles est créé en enlevant les parois d’une boîte de culture cellulaire à fond en verre de 35 mm x 10 mm (effectuée par un atelier d’usinage).
6. Soulevez l’objectif 40x jusqu’à ce que l’huile embrasse le fond de la lamelle en verre.

2. Configuration de l’isoflurane et préparation de la souris

1. Positionnez les composants électroniques du vaporisateur à faible débit (chambre d’anesthésie, tuyau, vaporisateur, cartouche de charbon) de manière à permettre au cône nasal et à la tubulure attachée d’atteindre l’insert (Figure 3A).
   ATTENTION : L’isoflurane est un anesthésique par inhalation et doit être manipulé avec précaution pour éviter les déversements et minimiser l’exposition humaine.
2. Mesurez le poids de la bouteille d’isoflurane avant utilisation et enregistrez-la. Fixez le bouchon du vaporisateur électronique à la bouteille d’isoflurane.
3. Connectez le cordon d’alimentation au vaporisateur électronique. Fermez les clips bleus du cône de nez et ouvrez les clips blancs de la chambre d’induction pour permettre à l’air de circuler à travers la chambre dans la cartouche de charbon de bois. Retirez le chapeau d’air ambiant rouge du côté gauche de la machine pour permettre à l’air de circuler.
4. Laisser le système se réchauffer pendant 5 minutes à 200 mL/min (faible débit) et 2 % d’isoflurane.
   REMARQUE : Bien que le réglage du cône de nez soit sélectionné, la ligne de cône de nez bleu doit rester fermée et la ligne blanche de la chambre d’induction doit rester ouverte.
5. Une fois que le système est correctement équilibré, purgez les conduites pour éliminer l’isoflurane restant de la chambre.
6. Placez la souris dans la chambre d’induction et sélectionnez High Flow. Terminez toute la préparation de la souris (c.-à-d. l’épilation, l’administration topique de médicaments, l’application d’une pommade pour les yeux, etc.) avant de poser le corps de l’animal sur l’insert. Confirmez que la souris est complètement anesthésiée à l’aide de la méthode du réflexe de pincement des orteils.
   1. Avec la jambe tendue, utilisez un ongle pour pincer fermement l’orteil sans causer de dommages physiques. Si la souris présente une réaction positive au stimulus (c’est-à-dire une rétraction des jambes, une contraction du pied, etc.), continuez à administrer un anesthésique dans la chambre jusqu’à ce qu’aucune réaction ne soit observée. Une fois correctement anesthésiée, la fréquence respiratoire de la souris devrait ralentir à ~55-65 respirations par minute¹⁸.
7. Lorsque la souris est complètement anesthésiée, sélectionnez à nouveau High Flow (Débit élevé) pour arrêter l’administration d’isoflurane. Purgez la chambre avant de l’ouvrir et ajustez les clips (bleu : ouvert ; blanc : fermé) pour délivrer l’isoflurane à travers le cône nasal. Sélectionnez Low Flow (Faible débit) pendant que le cône nasal est attaché à la souris pour continuer à administrer de l’isoflurane.
8. Vissez le tube d’isoflurane avec le cône de nez attaché à travers le support de tube d’angle de l’insert (Figure 3A et Figure 5).

3. Placement de la souris sur l’insert pour l’imagerie intravitale

1. Branchez la plaque chauffante sur le contrôleur (contenant une sonde anale attachée), allumez-la et laissez-la atteindre 36 °C (Figure 4A).
2. Retirez la souris anesthésiée de la chambre d’induction et posez-la sur la plaque chauffante (Figure 4B et Figure 5A). Effectuez le transfert de la chambre à l’insertion rapidement pour minimiser le temps pendant lequel la souris est active sans anesthésie par inhalation.
3. Fixez le cône de nez sur la souris (Figure 4B, C et Figure 5). Si nécessaire, utilisez du ruban adhésif pour sécuriser davantage l’angle et le positionnement du cône de nez.
4. Insérez la sonde anale et ajustez la température du contrôleur jusqu’à ce que la température du corps de la souris soit stable à ~36 °C (Figure 4A,B). Une fois que la souris est correctement positionnée, utilisez une pellicule plastique pour emprisonner la chaleur, si nécessaire, afin de maintenir davantage la température corporelle appropriée (Figure 4C).
5. Positionnez la souris de manière à ce que la tête s’aligne avec le disque de lamelle et immobilisez l’oreille au centre de la lamelle en verre à l’aide d’un clip d’oreille en métal (Figure 5A,B) ou d’un ruban adhésif (Figure 5C).
   REMARQUE : La pression du clip d’oreille métallique sur l’oreille peut être ajustée en desserrant la vis qui fixe le clip à l’insert. Un ressort métallique peut être ajouté pour une flexibilité accrue du serrage des clips.
   1. Pour modifier l’emplacement du clip d’oreille, dévissez le boulon à l’aide d’une clé Allen de 2,5 mm et transférez-le sur le site secondaire (Figure 2B,C). Lors du remontage du clip d’oreille, placez le clip contre l’insert, suivi de la rondelle sur le dessus. Utilisez un boulon pour fixer solidement le clip avec une légère force pour faire pivoter le clip.
6. Ajustez le positionnement z de l’objectif jusqu’à ce que les cellules se trouvent à l’intérieur du point focal (Figure 6A,D). Définissez les paramètres z-stack et time-lapse en fonction des objectifs expérimentaux et commencez l’acquisition d’images.
   REMARQUE : Si la configuration correcte est obtenue, l’oreille de la souris peut être photographiée pendant au moins 3 h consécutifs (Figure 6A',D').
   1. Une fois que les limites de la pile z sont définies, ajustez la puissance et le gain du laser pour vous assurer qu’aucun plan z n’est sursaturé afin de minimiser le photoblanchiment. Déterminez les paramètres de time-lapse à l’aide de l’épaisseur totale de la pile z, du nombre d’étapes (échantillonnage de Nyquist recommandé) et des intervalles de temps.
   2. Déterminer les paramètres d’imagerie (intervalles de temps, temps total d’imagerie, etc.) à l’aide de plusieurs facteurs, y compris la viabilité de l’animal sous anesthésie, le photoblanchiment/phototoxicité induit par le laser et l’objectif de l’imagerie en direct (c.-à-d. la dynamique de la division cellulaire, les interactions cellule-cellule, etc.).

4. Arrêt de l’imagerie

1. Allumez le coussin chauffant à circulation d’eau et réglez-le sur Cycle continu et 35 °C pendant au moins 30 minutes avant la fin de l’acquisition de l’image.
2. Une fois l’imagerie terminée, sélectionnez Low Flow sur le vaporisateur électronique pour arrêter l’administration d’isoflurane et déplacez la souris vers un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire.
3. Une fois réveillée, replacez la souris dans le récipient de transfert tout en continuant à la maintenir sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement ambulatoire. Surveillez constamment la souris lorsqu’elle est sur le coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle réponde.
4. Sur le vaporisateur électronique, cliquez sur Sélectionner le menu > Contrôle anesthésique > vide. Retirez le flacon d’isoflurane du système et replacez le bouchon du fabricant sur le flacon.
5. Mesurez le poids de la bouteille d’isoflurane et de la cartouche de charbon de bois et entrez les poids dans le journal. Une fois que la cartouche de charbon de bois pèse 50 g de plus que la mesure de base, jetez-la et remplacez-la par une nouvelle unité. Remettez l’isoflurane dans le coffre-fort.
6. Retirez le disque de lamelle et essuyez-le avec du papier pour lentilles et une solution pour lentilles. Rangez-le correctement pour éviter les rayures et le réutiliser.
7. Retirez la tubulure d’anesthésie du support d’insertion et dévissez l’insert de la platine du microscope.

Résultats

L’assemblage correct de l’insert d’imagerie en direct sur un microscope confocal inversé et l’orientation appropriée d’une souris transgénique au sommet de l’insert sont validés par l’acquisition d’empilements z de tissu auriculaire vivant marqué par fluorescence sur une période ≥1 h avec un minimum de signes de dérive dans les axes x, y et z. Les images doivent être capturées à intervalles réguliers (le temps d’intervalle dépendra de la question biologique, de la force du signal de fluore...

Discussion

Dans cette étude, nous présentons un nouvel outil qui facilite l’imagerie intravitale stable et à long terme des épithéliums cutanés intacts de souris sur des microscopes confocaux inversés. Cette invention est fabriquée en PLA, qui est le matériau imprimable en 3D le plus courant et le moins coûteux ; tous les coûts d’impression 3D en interne pour cet insert s’élèvent à 5 < $. Les deux pièces d’insertion séparées (Figure 1, Fichier supplémentaire 1...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging