Approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé

Résumé

Le protocole présente un nouvel outil pour simplifier l’imagerie intravitale à l’aide de la microscopie confocale inversée.

Résumé

Comprendre les comportements normaux et aberrants des cellules in vivo est nécessaire pour développer des interventions cliniques visant à contrecarrer l’initiation et la progression de la maladie. Il est donc essentiel d’optimiser les approches d’imagerie qui facilitent l’observation de la dynamique cellulaire in situ, où la structure et la composition des tissus restent inchangées. L’épiderme est la barrière la plus externe de l’organisme, ainsi que la source des cancers humains les plus répandus, à savoir les carcinomes cutanés de la peau. L’accessibilité des tissus cutanés offre une occasion unique de surveiller les comportements des cellules épithéliales et dermiques chez les animaux intacts à l’aide de la microscopie intravitale non invasive. Néanmoins, cette approche d’imagerie sophistiquée a été principalement réalisée à l’aide de microscopes multiphotoniques verticaux, qui représentent une barrière importante à l’entrée pour la plupart des chercheurs. Cette étude présente un insert de platine de microscope conçu sur mesure, imprimé en 3D, adapté à une utilisation avec des microscopes confocaux inversés, rationalisant l’imagerie intravitale à long terme de la peau de l’oreille chez des souris transgéniques vivantes. Nous pensons que cette invention polyvalente, qui peut être personnalisée pour s’adapter à la marque et au modèle de microscope inversé de votre choix et adaptée à l’imagerie de systèmes d’organes supplémentaires, s’avérera inestimable pour l’ensemble de la communauté de la recherche scientifique en améliorant considérablement l’accessibilité de la microscopie intravitale. Cette avancée technologique est essentielle pour renforcer notre compréhension de la dynamique des cellules vivantes dans des contextes normaux et pathologiques.

Introduction

La microscopie intravitale est un outil puissant qui permet de surveiller les comportements cellulaires dans leurs environnements in vivo non perturbés. Cette méthode unique a fourni des informations clés sur le fonctionnement interne de systèmes d’organes complexes de mammifères, notamment le poumon¹, le cerveau², le foie³, la glande mammaire⁴, l’intestin⁵ et la peau⁶. De plus, cette approche a révélé des altérations du comportement cellulaire au cours du développement de la tumeur⁷, de la cic....

Protocole

Cette recherche a été réalisée conformément aux directives de l’Université Emory et du centre médical des anciens combattants d’Atlanta sur les soins et l’utilisation des animaux et a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).

1. Installation de l’insert d’imagerie en direct sur la platine du microscope inversé

1. Construisez l’insert à l’aide de fichiers .stl (Fichier supplémentaire 1, Fichier supplémentaire 2 et Fichier supplémentaire 3) en spécifiant les dimensions et la conception 3D (voir Figure 1 et Figure 2A

Discussion

Dans cette étude, nous présentons un nouvel outil qui facilite l’imagerie intravitale stable et à long terme des épithéliums cutanés intacts de souris sur des microscopes confocaux inversés. Cette invention est fabriquée en PLA, qui est le matériau imprimable en 3D le plus courant et le moins coûteux ; tous les coûts d’impression 3D en interne pour cet insert s’élèvent à 5 < $. Les deux pièces d’insertion séparées (Figure 1, Fichier supplémentaire 1.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging