Optimierter intravitaler Bildgebungsansatz für die Langzeitüberwachung der Dynamik des Epithelgewebes auf einem inversen konfokalen Mikroskop

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt ein neues Werkzeug zur Vereinfachung der intravitalen Bildgebung mittels invertierter konfokaler Mikroskopie dar.

Zusammenfassung

Das Verständnis des normalen und aberranten Verhaltens von In-vivo-Zellen ist notwendig, um klinische Interventionen zu entwickeln, die den Ausbruch und das Fortschreiten der Krankheit vereiteln. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, bildgebende Verfahren zu optimieren, die die Beobachtung der Zelldynamik in situ ermöglichen, wo die Gewebestruktur und -zusammensetzung ungestört bleiben. Die Epidermis ist die äußerste Barriere des Körpers und die Quelle der häufigsten Krebserkrankungen des Menschen, nämlich des Hautkarzinoms. Die Zugänglichkeit von Hautgewebe bietet eine einzigartige Möglichkeit, das Verhalten von Epithel- und Hautzellen bei intakten Tieren mit nicht-invasiver intravitaler Mikroskopie zu überwachen. Nichtsdestotrotz wurde dieser ausgeklügelte Bildgebungsansatz in erster Linie mit aufrechten Multiphotonenmikroskopen erreicht, die für die meisten Forscher eine erhebliche Eintrittsbarriere darstellen. In dieser Studie wird ein speziell entwickelter, 3D-gedruckter Mikroskoptischeinsatz vorgestellt, der für die Verwendung mit inversen konfokalen Mikroskopen geeignet ist und die intravitale Langzeitbildgebung der Ohrhaut in lebenden transgenen Mäusen optimiert. Wir glauben, dass diese vielseitige Erfindung, die an die Marke und das Modell des inversen Mikroskops angepasst und an die Abbildung zusätzlicher Organsysteme angepasst werden kann, sich als unschätzbar wertvoll für die größere wissenschaftliche Forschungsgemeinschaft erweisen wird, indem sie die Zugänglichkeit der intravitalen Mikroskopie erheblich verbessert. Dieser technologische Fortschritt ist entscheidend für unser Verständnis der Dynamik lebender Zellen in normalen und krankheitsbedingten Kontexten.

Einleitung

Die intravitale Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Überwachung des Zellverhaltens in ihrer ungestörten In-vivo-Umgebung ermöglicht. Diese einzigartige Methode hat wichtige Einblicke in das Innenleben komplexer Organsysteme von Säugetieren geliefert, darunter Lunge¹, Gehirn², Leber³, Brustdrüse⁴, Darm⁵ und Haut⁶. Darüber hinaus hat dieser Ansatz Zellverhaltensänderungen während der Tumorentwicklung⁷, der Wundheilung^8,9,

Protokoll

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Emory University und des Atlanta Veterans Affairs Medical Center für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.

1. Einbau des Live-Imaging-Einsatzes auf den inversen Mikroskoptisch

1. Erstellen Sie die Einfügung mithilfe von STL-Dateien (Ergänzungsdatei 1, Ergänzungsdatei 2 und Ergänzungsdatei 3), die die 3D-Abmessungen und das Design angeben (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2A), einen 3D-Drucker und Polymilchsäur....

Diskussion

In dieser Studie stellen wir ein neues Werkzeug vor, das eine stabile, langfristige intravitale Bildgebung von intakten Hautepithelien der Maus auf inversen konfokalen Mikroskopen ermöglicht. Diese Erfindung besteht aus PLA, dem gebräuchlichsten und kostengünstigsten 3D-druckbaren Material; Alle internen 3D-Druckkosten für diesen Einsatz belaufen sich auf 5 <$. Die beiden separaten Einlegeteile (Abbildung 1, Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2) las.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging