도립 컨포칼 현미경에서 상피 조직 역학의 장기 모니터링을 위한 간소화된 생체 내 이미징 접근 방식

요약

이 프로토콜은 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 생체 내 이미징을 단순화하는 새로운 도구를 제공합니다.

초록

정상 및 비정상적인 생체 내 세포 거동을 이해하는 것은 질병 시작 및 진행을 막기 위한 임상 개입을 개발하는 데 필요합니다. 따라서 조직 구조와 구성이 교란되지 않는 세포의 역학을 현장에서 쉽게 관찰할 수 있는 이미징 접근 방식을 최적화하는 것이 중요합니다. 표피는 신체의 가장 바깥쪽 장벽일 뿐만 아니라 가장 흔한 인간 암, 즉 피부 피부암의 근원입니다. 피부 조직의 접근성은 비침습적 생체 내 현미경을 사용하여 온전한 동물의 상피 및 피부 세포 거동을 모니터링할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 이 정교한 이미징 접근 방식은 주로 정립 다광자 현미경을 사용하여 달성되었으며, 이는 대부분의 조사관에게 상당한 진입 장벽이 됩니다. 이 연구는 도립 컨포칼 현미경과 함께 사용하기에 적합한 맞춤형 3D 프린팅 현미경 스테이지 인서트를 제시하여 살아있는 형질전환 마우스에서 귀 피부의 장기 생체 내 이미징을 간소화합니다. 우리는 도립 현미경 브랜드와 선택한 모델에 맞게 맞춤화할 수 있고 추가 장기 시스템을 이미지화하는 데 적용할 수 있는 이 다재다능한 발명품이 생체 내 현미경의 접근성을 크게 향상시킴으로써 더 큰 과학 연구 커뮤니티에 매우 귀중한 것으로 입증될 것이라고 믿습니다. 이러한 기술 발전은 정상 및 질병 상황에서 살아있는 세포 역학에 대한 이해를 강화하는 데 매우 중요합니다.

서문

생체 내 현미경 검사는 생체 내 환경에서 교란되지 않은 세포 행동을 모니터링할 수 있는 강력한 도구입니다. 이 독특한 방법은 폐¹, 뇌², 간³, 유선4, 장⁵, 피부⁶을 포함한 복잡한 포유류 장기 시스템의 내부 작용에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다. 또한, 이 접근법은 종양 발생 중 세포 행동 변화⁷, 상처 치유 ^8,9, 염증¹⁰ 및 기타 다양한 상피내 병리를 밝혀냈다. 이 연구에서는 온전한 쥐 피부에서 살아있는 상피 및 기질 역학을 이미지화하기 위해 생체 내 현미경의 접근성을 높이는 데 중점을 둡니다. 포유류 피부의 세포 거동을 이해하는 것은 이 조직의 놀라운 재생 및 종양 생성 능력으로 인해 임상적으로 매우 중요합니다.

생쥐의 생체 내 이미징은 조직 깊이>100 μm^11,12에서 고해상도 이미징을 제공할 수 있는 능력으로 인해 정립 다광자 현미경을 사용하여 주로 수행되었습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 기기는 사용자 친화적이고 비용 효율적이며, 배양된 세포를 이미지화할 수 있는 기능을 제공하고, 이미지 획득 중에 완전한 어둠이 필요하지 않으며, 일반적으로 더 안전할 뿐만 아니라 다른 주목할만한 장점^13,14. 이 연구에서는 도립 컨포칼 현미경에 이 접근 방식을 적용하여 생체 내 이미징 접근성을 크게 향상시키는 새로운 도구를 제시합니다.

여기에서는 도립 컨포칼 현미경에서 쥐 귀 피부의 안정적이고 장기적인 생체 내 이미징을 용이하게 하기 위해 몇 가지 주요 기능을 통합한 3D 프린팅 맞춤형 스테이지 인서트 디자인을 소개합니다(그림 1, 그림 2, 그림 3, 그림 4 및 그림 5). 이러한 특수 기능에는 이미징 중에 성인 마우스의 전체 몸체를 완전히 평평하게 놓을 수 있는 오프셋 대물렌즈 구멍이 포함됩니다. 이는 이미징에서 마우스 몸 움직임의 진동 간섭을 최소화하고 호흡을 완화하기 위해 케타민과 자일라진을 투여할 필요가 없으며, 이는 종종 생체 내 이미징과 결합되는 관행입니다⁶. 또한 인서트의 코너 브래킷은 이소플루란 노즈 콘을 마우스 페이스에 맞게 올바르게 배치하고, 금속 이어 클립은 마우스 귀를 맞춤형 커버슬립 디스크에 고정하며, 옵션인 탈착식 폐쇄 루프 바이오피드백 히트 플레이트는 긴 이미징 세션 동안 마우스 체온을 지원하기 위해 인서트 내에 평평하게 놓여 있습니다. 마우스 머리와 귀를 평평하게 놓는 데 필수적인 평평한 표면을 제공하는 맞춤형 커버슬립 디스크는 기계 공장에서 일반 커버슬립 함유 세포 배양 접시의 벽을 제거하여 생성되었습니다. 커버슬립 디스크 및 맞춤형 스테이지 인서트와 함께 40x 실리콘 오일 이멀젼 렌즈(1.25 개구수[N.A.], 0.3mm 작동 거리)를 사용하여 귀 진피 깊이>50μm)의 고해상도 이미지를 제공합니다.

이 새로운 도립 현미경 스테이지 인서트의 기능을 테스트하기 위해 살아있는 형질전환 K14-H2B-mCherry¹⁵ 성체 마우스의 귀에서 3시간 동안 모든 표피 상피층에 걸쳐 있는 z-스택을 캡처했습니다(이 마우스 라인의 상피 핵에는 빨간색 형광 라벨이 포함되어 있음)(그림 6A-A'). 우리는 또한 살아있는 형질전환 Pdgfra-rtTA¹⁶의 귀에서 3시간 동안 피부 진피 내의 여러 섬유아세포층에 걸쳐 있는 z-스택을 캡처했습니다. pTRE-H2B-GFP¹⁷ 성체 마우스(이 마우스 라인의 섬유아세포 핵에는 독시사이클린 유도 후 녹색 형광 라벨이 포함되어 있음)(그림 6B-D'). 당사의 고해상도 데이터는 x-, y-, z-평면의 드리프트 부족으로 일관된 안정성을 보여주며, 이를 통해 도립 현미경에 사용할 수 있는 이 새로운 생체 내 이미징 도구의 효과를 입증합니다. 중요한 것은 이 3D 프린팅 스테이지 인서트의 치수는 보충 파일 1, 보충 파일 2 및 보충 파일 3에 설명된 대로 도립 현미경에 맞게 조정할 수 있으며, 대물렌즈 개구부의 위치를 인서트 내의 다른 위치로 이동하여 특정 조직 및/또는 관심 동물 모델의 이미징에 더 적합하게 만들 수 있다는 것입니다. 따라서 이 발명은 개별 실험실 또는 핵심 시설 공초점 접근 권한이 있는 연구자가 고유한 생체 내 이미징 요구 사항에 맞게 이 도구를 조정할 수 있도록 하여 다양한 생체 내 세포 생물학의 평가를 간소화할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 에모리 대학교와 애틀랜타 재향 군인 의료 센터의 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 도립 현미경 스테이지에 라이브 이미징 삽입물 설치

1. 3D 치수 및 설계(그림 1 및 그림 2A 참조), 3D 프린터 및 폴리락트산(PLA)을 지정하는 .stl 파일(보충 파일 1, 보충 파일 2 및 보충 파일 3)을 사용하여 삽입물을 구성합니다.
2. 인서트(그림 2B,C)를 대형 현미경 스테이지 홈(그림 2C 및 그림 3A)에 조심스럽게 놓습니다. 나사를 사용하여 인서트의 각 모서리에 있는 4개의 나사 구멍을 통해 인서트를 고정합니다(그림 2B-C).
   알림: 인서트는 양방향이며 현미경의 방향에 따라 180° 회전할 수 있습니다.tage 및 마취 장치.
3. 열판을 인서트 플러그 쪽에 밀어 넣고(그림 2D) 장치가 플러그 포트가 아래로 통과하는 하단 삽입 홈 위에 놓이도록 합니다.tage(그림 3B).
4. 인서트의 홈이 있는 원형 개구부를 40x 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈(그림 3C)에 맞추고 대물렌즈 중앙에 실리콘 오일을 바릅니다.
   1. 장시간(>1시간)에 걸쳐 이미징하는 경우 이미징 내내 커버슬립/대물렌즈 인터페이스에 남아 있는 오일을 넉넉하게 바르십시오. 렌즈 가장자리에 기름이 쏟아지지 않도록 하십시오.
5. 주사기를 사용하여 홈이 있는 원형 개구부를 따라 소량의 진공 그리스를 바르고 커버슬립 디스크를 그 위에 놓아 인서트를 밀봉합니다(그림 3D).
   알림: 커버슬립 디스크는 35mm x 10mm 유리 바닥 세포 배양 접시의 벽을 제거하여 생성됩니다(기계 공장에서 수행).
6. 오일이 유리 커버슬립의 바닥에 닿을 때까지 40x 대물렌즈를 올립니다.

2. 이소플루란 구성 및 마우스 준비

1. 저유량 전자 기화기 구성 요소(마취 챔버, 튜브, 기화기, 숯 캐니스터)를 배치하여 노즈 콘과 부착된 튜브가 인서트에 도달할 수 있도록 합니다(그림 3A).
   주의 : 이소플루란은 흡입 마취제이며 유출을 방지하고 인체 노출을 최소화하기 위해 주의해서 다루어야 합니다.
2. 사용하기 전에 이소플루란 병의 무게를 측정하고 기록하십시오. 전자 기화기의 캡을 이소플루란 병에 부착합니다.
3. 전원 코드를 전자 기화기에 연결합니다. 파란색 노즈 콘 클립을 닫고 흰색 유도 챔버 클립을 열어 챔버를 통해 숯 용기로 공기가 흐르도록 합니다. 공기 흐름이 허용되도록 장비 왼쪽에서 빨간색 주변 공기 캡을 제거합니다.
4. 시스템을 200mL/분(저유량) 및 2% 이소플루란에서 5분 동안 예열합니다.
   알림: 노즈콘 설정을 선택하더라도 파란색 노즈콘 라인은 닫힌 상태로 유지되어야 하고 흰색 유도 챔버 라인은 열린 상태로 유지되어야 합니다.
5. 시스템이 적절하게 평형을 이루면 라인을 퍼지하여 챔버에 남아 있는 이소플루란을 제거합니다.
6. 마우스를 유도 챔버에 놓고 High Flow를 선택합니다. 동물의 시체를 삽입물 위에 놓기 전에 모든 마우스 준비(예: 제모, 국소 약물 전달, 눈 연고 도포 등)를 완료하십시오. 발가락 꼬집기 반사 방법을 사용하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다.
   1. 다리를 쭉 뻗은 상태에서 손톱을 사용하여 물리적 손상 없이 발가락을 단단히 꼬집습니다. 마우스가 자극에 대해 양성 반응(즉, 다리 후퇴, 발 경련 등)을 보이면 반응이 관찰되지 않을 때까지 챔버 내에서 마취제를 계속 투여합니다. 적절하게 마취되면 마우스 호흡 속도는 분당 ~55~65회 호흡으로 느려져야 합니다¹⁸.
7. 마우스가 완전히 마취되면 High Flow를 다시 선택하여 isofluane 전달을 중지합니다. 열기 전에 챔버를 퍼지하고 클립(파란색: 열림, 흰색: 닫힘)을 조정하여 노즈 콘을 통해 이소플루란을 전달합니다. 노즈콘이 마우스에 부착된 상태에서 Low Flow를 선택하여 이소플루란 전달을 계속합니다.
8. 인서트의 코너 튜빙 브래킷을 통해 부착된 노즈 콘이 있는 이소플루란 튜빙을 끼웁니다(그림 3A 및 그림 5).

3. 생체 내 이미징을 위한 인서트에 마우스 배치

1. 열판을 컨트롤러(부착된 항문 프로브 포함)에 연결하고 전원을 켠 다음 플레이트가 36°C에 도달하도록 합니다(그림 4A).
2. 유도 챔버에서 마취된 마우스를 제거하고 열판을 가로질러 놓습니다(그림 4B 및 그림 5A). 흡입제 마취 없이 마우스가 활성화되는 시간을 최소화하기 위해 챔버에서 삽입으로 빠르게 이송합니다.
3. 노즈콘을 마우스에 고정합니다(그림 4B, C 및 그림 5). 필요한 경우 테이프를 사용하여 노즈콘의 각도와 위치를 더 고정합니다.
4. 항문 프로브를 삽입하고 마우스 체온이 ~36°C로 안정될 때까지 컨트롤러 온도를 조정합니다(그림 4A,B). 마우스를 올바르게 배치한 후 필요한 경우 플라스틱 랩을 사용하여 열을 가두어 적절한 체온을 추가로 유지합니다(그림 4C).
5. 헤드가 커버슬립 디스크와 정렬되도록 마우스를 배치하고 금속 이어 클립(그림 5A,B) 또는 테이프(그림 5C)를 사용하여 귀를 유리 커버슬립 중앙에 고정합니다.
   알림: 귀에 가해지는 금속 이어 클립의 압력은 클립을 인서트에 고정하는 나사를 풀어 조정할 수 있습니다. 클립 조임 유연성을 높이기 위해 금속 스프링을 추가할 수 있습니다.
   1. 이어 클립 위치를 변경하려면 2.5mm 육각 렌치로 볼트를 풀고 보조 사이트로 옮깁니다(그림 2B,C). 이어 클립을 재조립할 때 클립을 인서트에 대고 와셔를 위에 놓습니다. 볼트를 사용하여 약간의 힘으로 클립을 단단히 고정하여 클립을 회전시킵니다.
6. 셀이 초점 내에 올 때까지 대물렌즈 z 위치를 조정합니다(그림 6A,D). 실험 목표에 따라 z-stack 및 time-lapse 매개변수를 설정하고 이미지 획득을 시작합니다.
   알림: 올바르게 설정하면 마우스 귀를 최소 3시간 연속 이미징할 수 있습니다(그림 6A',D').
   1. z-stack 경계가 설정되면 레이저 출력과 게인을 조정하여 광표백을 최소화하기 위해 z-평면이 과포화되지 않도록 합니다. z-스택의 전체 두께, 단계 수(나이퀴스트 샘플링 권장) 및 시간 간격을 사용하여 타임랩스 파라미터를 결정합니다.
   2. 마취 상태에서 동물의 생존력, 레이저 유도 광표백/광독성 및 실시간 이미징의 목표(예: 세포 분열 역학, 세포 간 상호 작용 등)를 포함한 여러 요인을 사용하여 이미징 매개변수(시간 간격, 총 이미징 시간 등)를 결정합니다.

4. 이미징 종료

1. 물 순환 열 패드를 켜고 이미지 획득이 종료되기 전에 최소 35분 동안 연속 주기 와 30°C 로 설정합니다.
2. 이미징이 완료되면 전자 기화기에서 Low Flow 를 선택하여 이소플루란 전달을 중지하고 보행할 때까지 마우스를 열 패드로 이동합니다.
3. 깨어나면 완전히 보행할 수 있을 때까지 열 패드를 계속 유지하면서 마우스를 전송 컨테이너로 다시 이동합니다. 열 패드에 있는 동안 마우스가 응답할 때까지 마우스를 지속적으로 모니터링하십시오.
4. 전자 기화기에서 Select Menu(메뉴 선택) > Anesthetic Control(마취 제어) > Empty(비어 있음)를 클릭합니다. 시스템에서 이소플루란 병을 제거하고 제조업체의 캡을 병에 다시 끼웁니다.
5. 이소플루란 병과 숯통의 무게를 측정하고 로그에 무게를 입력합니다. 숯 용기의 무게가 기준 측정치보다 50g 초과되면 용기를 폐기하고 새 장치로 교체하십시오. 이소플루란을 금고에 돌려주세요.
6. 커버슬립 디스크를 제거하고 렌즈 용지와 렌즈 용액으로 깨끗이 닦습니다. 재사용을 위해 긁히지 않도록 적절하게 보관하십시오.
7. 인서트 브래킷에서 마취 튜브를 제거하고 현미경에서 인서트의 나사를 풉니다.tag이자형.

결과

도립 컨포칼 현미경에서 살아있는 이미징 삽입물의 적절한 조립과 삽입물 위에 있는 형질전환 마우스의 적절한 방향은 x축, y축 및 z축의 드리프트 증거를 최소화하면서 시간 경과≥1시간 동안 형광 라벨링된 살아있는 귀 조직의 z-스택을 획득하여 검증됩니다. 이미지는 시간이 지남에 따라 세포 역학 및 이미지 드리프트를 추적할 수 있도록 일정한 간격(간격 시간은 생물학적 질문, 형광 신호의 ?...

토론

이 연구에서는 도립 컨포칼 현미경에서 온전한 쥐 피부 상피의 안정적이고 장기적인 생체 내 이미징을 촉진하는 새로운 도구를 제시합니다. 이 발명품은 가장 일반적이고 저렴한 3D 프린팅 가능한 재료인 PLA로 만들어졌습니다. 이 인서트에 대한 모든 사내 3D 프린팅 비용은 <$5입니다. 두 개의 개별 삽입 조각(그림 1, 보충 파일 1 및 보충 파일 2)은 고정 나사를 사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging