도립 컨포칼 현미경에서 상피 조직 역학의 장기 모니터링을 위한 간소화된 생체 내 이미징 접근 방식

요약

이 프로토콜은 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 생체 내 이미징을 단순화하는 새로운 도구를 제공합니다.

초록

정상 및 비정상적인 생체 내 세포 거동을 이해하는 것은 질병 시작 및 진행을 막기 위한 임상 개입을 개발하는 데 필요합니다. 따라서 조직 구조와 구성이 교란되지 않는 세포의 역학을 현장에서 쉽게 관찰할 수 있는 이미징 접근 방식을 최적화하는 것이 중요합니다. 표피는 신체의 가장 바깥쪽 장벽일 뿐만 아니라 가장 흔한 인간 암, 즉 피부 피부암의 근원입니다. 피부 조직의 접근성은 비침습적 생체 내 현미경을 사용하여 온전한 동물의 상피 및 피부 세포 거동을 모니터링할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 이 정교한 이미징 접근 방식은 주로 정립 다광자 현미경을 사용하여 달성되었으며, 이는 대부분의 조사관에게 상당한 진입 장벽이 됩니다. 이 연구는 도립 컨포칼 현미경과 함께 사용하기에 적합한 맞춤형 3D 프린팅 현미경 스테이지 인서트를 제시하여 살아있는 형질전환 마우스에서 귀 피부의 장기 생체 내 이미징을 간소화합니다. 우리는 도립 현미경 브랜드와 선택한 모델에 맞게 맞춤화할 수 있고 추가 장기 시스템을 이미지화하는 데 적용할 수 있는 이 다재다능한 발명품이 생체 내 현미경의 접근성을 크게 향상시킴으로써 더 큰 과학 연구 커뮤니티에 매우 귀중한 것으로 입증될 것이라고 믿습니다. 이러한 기술 발전은 정상 및 질병 상황에서 살아있는 세포 역학에 대한 이해를 강화하는 데 매우 중요합니다.

서문

생체 내 현미경 검사는 생체 내 환경에서 교란되지 않은 세포 행동을 모니터링할 수 있는 강력한 도구입니다. 이 독특한 방법은 폐¹, 뇌², 간³, 유선4, 장⁵, 피부⁶을 포함한 복잡한 포유류 장기 시스템의 내부 작용에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다. 또한, 이 접근법은 종양 발생 중 세포 행동 변화⁷, 상처 치유 ^8,9, 염증¹⁰ 및 기타 다양한 상피내 병리를 밝혀냈다. 이 연구에서는 온전한 쥐 피부에서 살아있는 상피 및 기질 역학을 이미지화하기 위해 생체 내 현미경의 접근성을 높이는 데 중점을 둡니다. 포유류 피부의 세포 거동을 이해하는 것은 이 조직의 놀라운 재생 및 종양 생성 능력으로 인해 임상적으로 매우 중요합니다.

생쥐의 생체 내 이미징은 조직 깊이>100....

프로토콜

이 연구는 에모리 대학교와 애틀랜타 재향 군인 의료 센터의 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 도립 현미경 스테이지에 라이브 이미징 삽입물 설치

1. 3D 치수 및 설계(그림 1 및 그림 2A 참조), 3D 프린터 및 폴리락트산(PLA)을 지정하는 .stl 파일(보충 파일 1, 보충 파일 2 및 보충 파일 3)을 사용하여 삽입물을 구성합니다.
2. 인서트(그림 2B,C)를 대형 현미경 스테이지 홈(그림 2C 및 그림 3A)에 조심스럽게 놓습니다. 나사를 사용하여 인서트의 각 모서리에 있는 4개의 나사 구멍을 통해 인서트를 고정합니다(그림 2B-C

토론

이 연구에서는 도립 컨포칼 현미경에서 온전한 쥐 피부 상피의 안정적이고 장기적인 생체 내 이미징을 촉진하는 새로운 도구를 제시합니다. 이 발명품은 가장 일반적이고 저렴한 3D 프린팅 가능한 재료인 PLA로 만들어졌습니다. 이 인서트에 대한 모든 사내 3D 프린팅 비용은 <$5입니다. 두 개의 개별 삽입 조각(그림 1, 보충 파일 1 및 보충 파일 2)은 고정 나사를 사?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging