استخدام نباتات جلد الطيور لدراسة أنماط الأنسجة وتكوين الأعضاء

Summary

هنا نصف بروتوكولات لثلاثة أنواع من مزارع زرع الجلد الجنيني للطيور التي يمكن استخدامها لفحص تفاعلات الأنسجة ، وفيلم التصوير الفاصل الزمني 4D (3D plus time) ، والاضطراب العالمي أو المحلي للوظيفة الجزيئية ، وتوصيف بيولوجيا الأنظمة.

Abstract

يعد جلد الطيور النامي أثناء التطور الجنيني نموذجا فريدا يمكن أن يوفر رؤى قيمة حول أنماط الأنسجة. فيما يلي ثلاثة اختلافات في مزارع زراعة الجلد لفحص الجوانب المختلفة لنمو الجلد. أولا ، توفر ثقافات الأعضاء خارج الجسم الحي والتلاعب فرصا للباحثين لمراقبة ودراسة تطور براعم الريش مباشرة. يمكن أن تنمو زراعة الجلد لمدة 7 أيام مما يتيح التحليل المباشر للسلوك الخلوي والتصوير 4D على فترات خلال فترة النمو هذه. وهذا يسمح أيضا للتلاعب الفيزيائي والجزيئي لظروف الثقافة لتصور استجابة الأنسجة. على سبيل المثال ، يمكن تطبيق الخرز المطلي بعامل النمو محليا لإحداث تغييرات في نقوش الريش في منطقة محدودة. بدلا من ذلك ، يمكن توصيل النقل الفيروسي عالميا في وسائط الثقافة لزيادة أو تقليل التعبير الجيني. ثانيا ، يسمح بروتوكول إعادة تركيب الجلد للباحثين بالتحقيق في تفاعلات الأنسجة بين البشرة واللحمة المتوسطة المشتقة من مناطق الجلد المختلفة أو مراحل الحياة المختلفة أو الأنواع المختلفة. وهذا يتيح فرصة لاختبار النافذة الزمنية التي تكون فيها الظهارة مؤهلة للاستجابة للإشارات وقدرتها على تكوين زوائد جلدية مختلفة استجابة لإشارات من مصادر مختلفة للحمة المتوسطة. ثالثا ، إعادة تكوين الجلد باستخدام خلايا جلدية منفصلة مغطاة بظهارة سليمة تعيد نمو الجلد وتمكن من دراسة العمليات الأولية للأنماط الدورية. يعزز هذا النهج أيضا قدرتنا على التعامل مع التعبير الجيني بين الخلايا المنفصلة قبل إنشاء نبات الجلد المعاد تشكيله. تقدم هذه الورقة بروتوكولات الاستزراع الثلاثة والتجارب النموذجية لإثبات فائدتها.

Introduction

يعد تطور جلد جنين الطيور نموذجا ممتازا لدراسة آليات التشكل بسبب الأنماط المميزة وإمكانية الوصول إلى الجراحة المجهرية والتلاعب^1،2. ومع ذلك ، قد يكون تقييم الأحداث الخلوية والجزيئية في الأنسجة السليمة أمرا صعبا لأن وجود الأنسجة الدخيلة يمكن أن يعقد الملاحظات المجهرية. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على التلاعب بالتعبير الجيني لاختبار دورها في تشكل الجلد ليست دائما مهمة بسيطة. نجد أنه يمكننا اختبار وظائف الجينات باستخدام نقل الفيروسات القهقرية بمعدل نجاح أعلى باستخدام نماذج زراعة الجلد. نناقش هنا مزايا ثلاثة نماذج لزرع الجلد تم تطويرها.

زراعة الجلد الجنيني للطيور هي نظام قوي لتقييم سلوك الخلية وتنظيم الجينات ووظيفتها أثناء تطور برعم ريشة الجلد^3،4،5،6. يسمح بتقييم الآليات الجزيئية لتطور برعم الريش من خلال الإضافة العالمية لعوامل النمو الموضوعة في وسائط الاستزراع أو إطلاقها محليا من الخرز المطلي بعامل النمو. يمكن أيضا التلاعب بالجينات التنظيمية التنموية باستخدام نقل الجينات الفيروسية للأشكال السلبية السليمة أو السائدة للدراسات الوظيفية التي تقيم أدوارها في أحداث مورفوجينية محددة ^7,8.

تمكن ثقافة إعادة التركيب الظهارية والوسيطة للطيور الباحثين من تحديد مساهمات كل مكون من مكونات الجلد خلال المراحل المبكرة من تشكل الجلد. كشف استخدام رولز لهذا النهج أن التفاعلات بين اللحمة المتوسطة والظهارة ضرورية لتشكيل الزوائد^{الجلدية 9}. يمكن أن يشكل اللحمة المتوسطة تكاثفات وهناك حاجة إلى ظهارة للحث والحفاظ على تكوينات تكثيف اللحمة^{المتوسطة 2}. في وقت لاحق ، تم استخدام هذا النهج لتقييم سبب فشل الدجاج بلا قشور في تكوين الريش. تم اكتشاف أن العيب موجود في اللحمة المتوسطة¹⁰. أجرى Dhouailly دراسات إعادة التركيب الظهاري الوسيطة للأنسجة في أجنة من أنواع مختلفة. قدمت هذه الدراسات رؤى تنموية وتطورية في الاتصالات الظهارية المتوسطة التي تعزز تشكل الجلد³.

تم استخدام هذه الدراسة لفهم العوامل التي تتحكم في نمو الريش بشكل أفضل. تعمل الطريقة أيضا على تحسين تصور الأحداث الخلوية والجزيئية التي تنطوي عليها أنماط الجلد التي تحدث أثناء بدء الريش وتطوره واستطالته على طول المحور الأمامي الخلفي. عندما يتم فصل الظهارة عن اللحمة المتوسطة ثم يتم إعادة دمج المكونين ، فإن التفاعلات الجديدة تعيد تأسيس نمط الجلد. يسمح لنا هذا النهج بتقييم الإشارات المحفزة للحمة المتوسطة وجزيئات الكفاءة الظهارية التي تمكن البشرة من الاستجابة لإشارات اللحمة المتوسطة¹¹. يمكن أيضا فحص التعبير الجزيئي اللاحق المطلوب لتطوير برعم الريش وتشكيل الأنماط. أثبتت هذه الدراسات أن موقع البراعم يتحكم فيه اللحمة المتوسطة. يوضح دوران الظهارة 90^o قبل إعادة التركيب مع اللحمة المتوسطة أن اتجاه استطالة برعم الريش يتم التحكم فيه بواسطة الظهارة. كانت هذه الطريقة ضرورية بالنسبة لنا لدراسة الآلية الجزيئية التي تنظم اتجاه برعم الريش¹².

ثقافة إعادة تكوين جلد الطيور ، حيث يتم فصل اللحمة المتوسطة للجلد إلى خلايا مفردة قبل الطلاء بكثافة عالية للخلايا وتغطيتها بظهارة سليمة ، تعيد الخلايا الجلدية إلى حالة بدائية. ثم ينظم الزرع نفسه لتشكيل نمط دوري جديد مستقل عن الإشارات السابقة¹³. يمكن استخدام نموذج إعادة تكوين الجلد هذا لدراسة العمليات الأولية للزخرفة الدورية للريش. استخدمنا هذا الأسلوب لاستكشاف كيف يمكن أن يؤثر تعديل نسبة خلايا اللحمة المتوسطة إلى قطعة واحدة من الظهارة على حجم أو عدد براعم الريش. وجد أن عدد البراعم يزداد ولكن ليس حجم البراعم مع زيادة نسبة خلايا اللحمة المتوسطة. ميزة أخرى لهذا النهج هي أن النقل الفيروسي للخلايا الوسيطة يظهر كفاءة أعلى مما هو عليه في حالتي الثقافة الأخريين ويمكن أن ينتج أنماطا ظاهرية أكثر وضوحا.

Protocol

1. زراعة جلد الدجاج (الشكل 1)

1. احتضان بيض الدجاج المخصب في حاضنة مرطبة عند 38 درجة مئوية وترتيبها وفقا ل Hamburger و Hamilton¹⁴.
   1. في المرحلة 28 (~ E5.5) ، يكون الرقم الثاني للطرف وإصبع القدم الثالث أطول من الآخرين ؛ ثلاثة أرقام وأربعة أصابع متميزة.
   2. في المرحلة 29 (~ E6) ، ينحني الجناح عند الكوع ؛ الرقم الثاني أطول بشكل واضح من الأرقام الأخرى.
   3. في المرحلة 30 (~ E6.5) ، يظهر صفان من برعم الريش الظهري على جانبي الحبل الشوكي على المستوى العضدي وثلاثة صفوف على مستوى الساقين.
   4. في المرحلة 31 (~ E7) ، هناك ~ 7 صفوف من الريش على المستويات العجزية.
   5. في المرحلة 32 ، يوجد أحد عشر صفا أو أكثر من براعم الريش على مستوى الساقين.
2. ضع جنين دجاج المرحلة 28-32 في طبق بتري 60 مم يحتوي على محلول ملحي مخزن من هانكس (HBSS) أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
   1. تشريح الجلد الظهري الجنيني بين أسفل الرقبة إلى منطقة الذيل. استخدم المقص لإزالة الرأس من الرقبة. اسحب براعم الأطراف برفق لوضع الجانب البطني من الجسم لأسفل مع انتشار الزوائد للخارج.
   2. قم بعمل شق أمامي إلى خلفي في الجلد على طول الجانبين الجانبيين لجسم الجنين باستخدام ملقط صانع الساعات أو مقص زنبركي حاد. تأكد من تثبيت الجسم بزوج من الملقط عن طريق قرص براعم الأطراف طوليا. قشر الجلد برفق من الرقبة إلى منطقة الذيل أو من الذيل إلى الرقبة باستخدام ملقط صانع الساعات.
3. قم بإزالة الأنسجة تحت الجلد التي تظل ملتصقة بالجلد المقشر برفق وقم بتنعيم حواف الجلد باستخدام مقص الربيع الحاد.
4. أضف 2 مل / بئر من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ومحلول البنسلين / الستربتومايسين (مخفف 1: 100) إلى بئر في طبق مكون من 6 آبار. بمجرد إضافة الوسط والمضادات الحيوية ، ضع ملحق زراعة الأنسجة المعقمة داخل البئر ، بحيث تكون الوسائط على السطح الخارجي لملحق الاستزراع.
5. انقل الجلد باستخدام ملعقة إلى ملحق المزرعة مع توجيه البشرة لأعلى وتوجيه اللحمة المتوسطة لأسفل على غشاء الإدخال. للتأكد من أن الجلد مسطح دون أي تجاعيد ، اسحب الجلد على الملعقة في HBSS. حرك الجلد من الملعقة بالسائل لتسهيل نقل الجلد دون طي.
6. قم بإزالة HBSS الزائد من ملحق الثقافة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. اترك طبقة رقيقة من HBSS داخل ملحق الثقافة للحفاظ على النبات شبه رطب لتوفير واجهة هواء سائلة.
7. احتضان مزارع زرع الجلد عند 37 درجة مئوية باستخدام 5٪ CO₂ و 95٪ هواء. تغيير المتوسطة كل 2 أيام.
   ملاحظة: تم نشر هذا الإجراء⁴. يمكن أيضا استخدام نظام الاستزراع هذا مع جلد الطيور الأخرى مثل مزارع السمان أو جلد العصافير.

2. إعادة تركيب جلد الدجاج الظهاري الوسيطة (الشكل 2)

1. احتضان بيض الدجاج المخصب في حاضنة مرطبة عند 38 درجة مئوية وترتيب الأجنة وفقا ل Hamburger and Hamilton¹⁴ (القسم 1.1).
2. تحضير 2x محلول ملحي خال من الكالسيوم والمغنيسيوم (CMF) مع محلول مؤقت بنسبة 0.25٪ من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA).
   1. اصنع 10x CMF buffer (كلوريد الصوديوم (1.37 م) 80 جم ، KCl (0.04 م) 3 جم ، NaH₂PO4 (0.004 م) 0.5 جم ، KH₂PO4 (2 م) 0.25 جم ، NaHCO₃ (0.12 م) 10 جم ، الجلوكوز (0.1 م) 20 جم في 1000 مل من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3. لصنع 100 مل من 2x CMF مع 0.25٪ EDTA عازلة ، يجب إذابة EDTA في 80 مل من الماء المقطر أولا ، ثم إضافة 20 مل من 10x CMF buffer لصنع 2x CMF مع 0.25٪ EDTA حل العمل.
3. تشريح المرحلة 30-32 من الجلود الظهرية لجنين الدجاج في HBSS كما هو موضح أعلاه (القسم 1.2) واحتضانها في محلول ملحي 2x CMF مع 0.25٪ EDTA على الجليد لمدة 15-20 دقيقة.
4. افصل بعناية بين الظهارة واللحمة المتوسطة باستخدام ملقط صانع الساعات. انقل الظهارة المنفصلة واللحمة المتوسطة إلى طبق نظيف يحتوي على HBSS.
5. أعد دمج الظهارة مع اللحمة المتوسطة عن طريق وضع اللحمة المتوسطة أولا على طبق بتري يحتوي على HBSS ، ثم ضع الظهارة فوق اللحمة المتوسطة. ضع الظهارة على طول نفس المحور الأمامي الخلفي مثل اللحمة المتوسطة أو أدر الظهارة 90^o من المحور الأمامي الخلفي للحمة المتوسطة لتحديد المكون الذي ينظم الجوانب المختلفة لتشكل الجلد.
6. انقل الجلود المعاد تجميعها إلى إدخالات الثقافة في أطباق استزراع 6 آبار للنمو وإزالة HBSS الزائد حول الجلد المعاد تجميعه.
7. ضع 2 مل من وسط زراعة DMEM مع 10٪ FBS في البئر خارج الملحق. ضع طبقة رقيقة من DMEM داخل حجرة الإدخال للحفاظ على النبات شبه رطب لتوفير واجهة هواء سائلة.
8. احتضان مؤتلف الجلد عند 37 درجة مئوية في خليط من 5٪ CO₂ و 95٪ هواء. تغيير المتوسطة كل 2 أيام. قم بتوثيق التغيرات في النمط الظاهري في مراحل الجلد الأولية لتطور الجلد باستخدام التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني باستخدام كاميرا مثبتة على مجهر تشريح.
   ملاحظة: تم نشر هذا الإجراء¹¹.

3. إعادة تكوين جلد الدجاج (الشكل 3)

1. احتضان بيض الدجاج المخصب في حاضنة مرطبة عند 38 درجة مئوية وترتيب الأجنة وفقا ل Hamburger and Hamilton¹⁴ (القسم 1.1).
2. تشريح المرحلة 30-33 الجلود الظهرية لجنين الدجاج في HBSS. احتضان القشرة في محلول ملحي 2x CMF مع 0.25٪ EDTA على الثلج لمدة 15-20 دقيقة كما هو موضح أعلاه (القسم 2.3).
3. افصل بعناية بين الظهارة واللحمة المتوسطة باستخدام ملقط صانع الساعات. نقل الظهارة المنفصلة واللحمة المتوسطة إلى HBSS على الجليد.
   ملاحظة: احرص على عدم إتلاف الطبقة القاعدية للظهارة عند فصل الظهارة عن اللحمة المتوسطة.
4. اجمع اللحمة المتوسطة المنفصلة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل واحتضانها بمحلول كولاجيناز / تربسين 0.1٪ مصنوع في برنامج تلفزيوني في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
5. افصل اللحمة المتوسطة للجلد باستخدام ماصة باستور لعمل تعليق أحادي الخلية. أضف DMEM مع 10٪ FBS لوقف عملية الهضم.
6. بيليه وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 233 × غرام لمدة 5 دقائق. يعاد تعليق الخلايا بوسط استزراع بتركيز 2 × 10⁷ خلايا / مل.
   ملاحظة: في هذه الخطوة ، يمكن أيضا إعادة تعليق خلايا اللحمة المتوسطة في وسط يحتوي على فيروس لمدة 2-3 ساعات على الجليد لنقل الجينات.
7. ضع ملحق زراعة الخلايا في بئر واحد من طبق مكون من 6 آبار. إسقاط 10 ميكرولتر من 2 × 10⁷ خلايا / مل خلايا اللحمة المتوسطة على إدراج زراعة الأنسجة. ضع 2 مل من وسط زراعة DMEM مع 10٪ FBS في البئر خارج الملحق. احتضان خلايا اللحمة المتوسطة المطلية عند 37 درجة مئوية باستخدام حاضنة هواء 5٪ CO₂ و 95٪ لمدة 1 ساعة للسماح للخلايا بالاستقرار على غشاء الإدخال.
8. انقل الظهارة السليمة أعلى قطرة اللحمة المتوسطة المطلية مع طبقة الخلايا القاعدية الظهارية التي تواجه خلايا اللحمة المتوسطة باستخدام ماصة 1 مل.
   ملاحظة: عند نقل الظهارة إلى قطرة اللحمة المتوسطة ، لا ينبغي إزعاج خلايا اللحمة المتوسطة.
9. قم بتسطيح الظهارة السليمة فوق اللحمة المتوسطة لجعل الجلد المعاد تشكيله يزرع. اترك طبقة رقيقة من الوسط على الملحق للحفاظ على الجلد المعاد تشكيله شبه مبلل لتوفير واجهة هواء سائلة. احتضان نبتة الجلد المعاد تشكيلها عند 37 درجة مئوية في حاضنة هواء 5٪ CO₂ و 95٪. تغيير المتوسطة كل 2 أيام.
   ملاحظة: تم نشر هذا الإجراء¹³.

النتائج

مزارع زرع الجلد
يمكن ملاحظة تطور برعم الريش من ثقافات أعضاء الجلد خارج الجسم الحي مباشرة تحت المجهر. باستخدام نموذج زراعة الجلد للجلد الظهري للمرحلة 30 من الدجاج ، تظهر اللافتات على طول خط الوسط. ثم تنتشر الجبهة المورفولوجية تدريجيا بشكل جانبي نحو محيط الجلد مع تكوين ريشة ب?...

Discussion

توفر إعادة تركيب الأنسجة مقايسة لاستكشاف المساهمات الفريدة للظهارة واللحمة المتوسطة. في الدجاج ، يبدأ الريش في التطور في اليوم الجنيني 7 (E7) بينما تبدأ القشور في E9. عندما يتم إعادة دمج اللحمة المتوسطة على نطاق E9 مع ظهارة الريش E7 ، تشكل الأنسجة المعاد تجميعها قشور ، وعندما يتم إعادة دمج اللح?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042