Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir Protokolle für drei Arten von embryonalen Hautexplantatkulturen von Vögeln, die zur Untersuchung von Gewebeinteraktionen, 4D-Bildgebungs-Zeitrafferfilmen (3D plus Zeit), globalen oder lokalen Störungen der molekularen Funktion und systembiologischer Charakterisierung verwendet werden können.

Zusammenfassung

Die sich entwickelnde Vogelhaut während der Embryogenese ist ein einzigartiges Modell, das wertvolle Einblicke in die Gewebemusterung liefern kann. Im Folgenden werden drei Varianten von Hautexplantatkulturen beschrieben, um verschiedene Aspekte der Hautentwicklung zu untersuchen. Erstens bieten Ex-vivo-Organkulturen und -Manipulationen den Forschern die Möglichkeit, die Entwicklung von Federknospen direkt zu beobachten und zu untersuchen. Die Explantatkultur der Haut kann 7 Tage lang wachsen, was eine direkte Analyse des zellulären Verhaltens und 4D-Bildgebung in Intervallen während dieser Wachstumsperiode ermöglicht. Dies ermöglicht auch physikalische und molekulare Manipulationen der Kulturbedingungen, um die Gewebereaktion sichtbar zu machen. Zum Beispiel können mit Wachstumsfaktoren beschichtete Kügelchen lokal aufgetragen werden, um Veränderungen in der Federmusterung in einem begrenzten Bereich zu induzieren. Alternativ kann die virale Transduktion global in den Nährmedien verabreicht werden, um die Genexpression zu erhöhen oder herunterzuregulieren. Zweitens ermöglicht das Hautrekombinationsprotokoll den Forschern, Gewebeinteraktionen zwischen Epidermis und Mesenchym zu untersuchen, die aus verschiedenen Hautregionen, verschiedenen Lebensstadien oder verschiedenen Arten stammen. Dies bietet die Möglichkeit, das Zeitfenster zu testen, in dem das Epithel in der Lage ist, auf Signale zu reagieren, und seine Fähigkeit, verschiedene Hautanhänge als Reaktion auf Signale aus verschiedenen mesenchymalen Quellen zu bilden. Drittens setzt die Hautrekonstitution mit dissoziierten Hautzellen, die mit intaktem Epithel überlagert sind, die Hautentwicklung zurück und ermöglicht die Untersuchung der anfänglichen Prozesse der periodischen Musterbildung. Dieser Ansatz verbessert auch unsere Fähigkeit, die Genexpression zwischen den dissoziierten Zellen zu manipulieren, bevor das rekonstituierte Hautexplantat erstellt wird. In diesem Artikel werden die drei Kulturprotokolle und beispielhafte Experimente vorgestellt, um ihren Nutzen zu demonstrieren.

Einleitung

Die Entwicklung der Haut von Vogelembryonen ist aufgrund der unterschiedlichen Muster und des Zugangs zu Mikrochirurgie und -manipulation ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Morphogenese ^1,2. Die Bewertung zellulärer und molekularer Ereignisse in intaktem Gewebe kann jedoch schwierig sein, da das Vorhandensein von Fremdgewebe mikroskopische Beobachtungen erschweren kann. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren, um ihre Rolle bei der Morphogenese der Haut zu testen, nicht immer eine einfache Aufgabe. Wir stellen fest, dass wir Genfunktionen mittels retroviraler Transduktion mit einer höheren Erfolgsrate unter Verwendung von Hautexplantatmodellen testen können. Hier gehen wir auf die Vorteile von drei Hautexplantatmodellen ein, die entwickelt wurden.

Die embryonale Hautkultur von Vögeln ist ein leistungsfähiges System zur Beurteilung des Zellverhaltens, der Genregulation und der Funktion während der Entwicklung von Hautfederknospen 3,4,5,6. Es ermöglicht die Bewertung der molekularen Mechanismen der Entwicklung von Federknospen durch die globale Zugabe von Wachstumsfaktoren, die in das Kulturmedium eingebracht werden, oder deren lokale Freisetzung aus Wachstumsfaktor-beschichteten Kügelchen. Entwicklungsregulatorische Gene können auch durch virale Gentransduktion intakter oder dominanter negativer Formen für funktionelle Studien manipuliert werden, um ihre Rolle bei spezifischen morphogenetischen Ereignissen zu bewerten ^7,8.

Die epithelial-mesenchymale Rekombinationskultur von Vögeln ermöglicht es den Forschern, die Beiträge der einzelnen Hautkomponenten in den frühen Stadien der Hautmorphogenese zu bestimmen. Rawles' Anwendung dieses Ansatzes zeigte, dass Wechselwirkungen zwischen dem Mesenchym und dem Epithel für die Bildung von Hautanhängen unerlässlich sind⁹. Das Mesenchym kann Kondensationen bilden, und das Epithel wird benötigt, um mesenchymale Kondensationsbildungen zu induzieren und aufrechtzuerhalten². Später wurde dieser Ansatz verwendet, um zu beurteilen, warum schuppenlose Hühner keine Federn bilden. Es wurde festgestellt, dass der Defekt im Mesenchym¹⁰ liegt. Dhouailly führte Studien zur epithelial-mesenchymalen Rekombination von Gewebe an Embryonen verschiedener Spezies durch. Diese Studien lieferten entwicklungs- und evolutionäre Einblicke in die epithelial-mesenchymale Kommunikation, die die Morphogenese der Haut fördert³.

Diese Studie wurde verwendet, um Faktoren, die das Federwachstum steuern, besser zu verstehen. Die Methode verbessert auch die Visualisierung zellulärer und molekularer Ereignisse, die an der Hautmusterung beteiligt sind und während der Initiierung, Entwicklung und Verlängerung der Federn entlang der anterior-posterioren Achse stattfinden. Wenn das Epithel vom Mesenchym getrennt wird und die beiden Komponenten dann wieder kombiniert werden, stellen neue Wechselwirkungen die Hautmusterung wieder her. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, mesenchymale induzierende Signale und epitheliale Kompetenzmoleküle zu bewerten, die es der Epidermis ermöglichen, auf die mesenchymalen Signale zu reagieren¹¹. Die anschließende nachgeschaltete molekulare Expression, die für die Entwicklung der Federknospen und die Musterbildung erforderlich ist, kann ebenfalls untersucht werden. Diese Studien haben gezeigt, dass die Position der Knospen durch das Mesenchym gesteuert wird. Die Rotation des Epithels um 90^o vor der Rekombination mit dem Mesenchym zeigt, dass die Richtung der Federknospenverlängerung durch das Epithel gesteuert wird. Diese Methode war für uns unerlässlich, um den molekularen Mechanismus zu untersuchen, der die Ausrichtung der Federknospen reguliert¹².

Die Rekonstitutionskultur der Vogelhaut, in der das Hautmesenchym in einzelne Zellen dissoziiert wird, bevor es mit hoher Zelldichte plattiert und mit intaktem Epithel überlagert wird, versetzt die Hautzellen in einen primordialen Zustand. Das Explantat organisiert sich dann selbst, um ein neues periodisches Muster zu bilden, das unabhängig von den vorherigen Hinweisen¹³ ist. Dieses Hautrekonstitutionsmodell kann verwendet werden, um die ersten Prozesse der periodischen Musterbildung von Federn zu untersuchen. Wir haben diesen Ansatz verwendet, um zu untersuchen, wie die Modulation des Verhältnisses von mesenchymalen Zellen zu einem einzelnen Stück Epithel die Größe oder Anzahl der Federknospen beeinflussen kann. Es wurde festgestellt, dass die Anzahl der Knospen zunahm, aber nicht die Größe der Knospen, da das Verhältnis der mesenchymalen Zellen zunahm. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die mesenchymale zelluläre Virustransduktion eine höhere Effizienz aufweist als unter den beiden anderen Kulturbedingungen und offensichtlichere Phänotypen hervorbringen kann.

Protokoll

1. Explantatkultur aus Hühnerhaut (Abbildung 1)

1. Befruchtete Hühnereier in einem befeuchteten Brutkasten bei 38 °C inkubieren und nach Hamburger und Hamilton¹⁴ inszenieren.
   1. Im Stadium 28 (~E5.5) sind der zweite Zeh und die dritte Zehe der Gliedmaße länger als die anderen; Drei Zehen und vier Zehen sind unterschiedlich.
   2. Bei Stufe 29 (~E6) ist der Flügel am Ellbogen gebeugt; Die zweite Ziffer ist deutlich länger als die anderen.
   3. Im Stadium 30 (~E6.5) sind zwei Reihen der dorsalen Federknospen zu beiden Seiten des Rückenmarks auf der Höhe des Armes und drei Reihen auf Höhe der Beine sichtbar.
   4. Auf Stufe 31 (~E7) gibt es ~7 Reihen von Federn auf der Jumbo-Sakral-Ebene.
   5. Im Stadium 32 sind elf oder mehr Reihen von Federknospen auf Höhe der Beine vorhanden.
2. Legen Sie einen Hühnerembryo im Stadium 28-32 in eine 60-mm-Petrischale, die Hanks-gepufferte Kochsalzlösung (HBSS) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält.
   1. Präparieren Sie die Rückenhaut des Embryos zwischen dem unteren Hals und der Schwanzregion. Verwenden Sie eine Schere, um den Kopf vom Hals zu entfernen. Ziehe vorsichtig an den Knospen der Gliedmaßen, um die Bauchseite des Körpers nach unten zu positionieren, wobei sich die Gliedmaßen nach außen spreizen.
   2. Machen Sie einen vorderen bis hinteren Schnitt in der Haut entlang der beiden flankierenden Seiten des Embryokörpers mit einer Uhrmacherzange oder einer scharfen Federschere. Achte darauf, den Körper mit einer Pinzette zu stabilisieren, indem du die Knospen der Gliedmaßen in Längsrichtung einklemmst. Schälen Sie die Haut vorsichtig vom Hals bis zum Schweif oder vom Schwanz bis zum Hals mit einer Uhrmacherzange.
3. Entfernen Sie vorsichtig das Unterhautgewebe, das an der geschälten Haut haftet, und glätten Sie die Hautränder mit der scharfen Federschere.
4. Geben Sie 2 ml/Vertiefung des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin-Lösung (verdünnt 1:100), in eine Vertiefung in einer 6-Well-Schale. Nachdem das Medium und die Antibiotika hinzugefügt wurden, legen Sie einen sterilen Gewebekultureinsatz so in die Vertiefung, dass sich das Medium an der Außenseite des Kultureinsatzes befindet.
5. Übertragen Sie die Haut mit einem Spatel auf den Kultureinsatz, wobei die Epidermis nach oben und das Mesenchym nach unten auf die Einlegemembran zeigt. Um sicherzustellen, dass die Haut flach und ohne Falten aufliegt, ziehen Sie die Haut auf den Spatel in HBSS. Schieben Sie die Haut mit der Flüssigkeit vom Spatel ab, um die Übertragung der Haut ohne Falten zu erleichtern.
6. Entfernen Sie überschüssiges HBSS mit einer 200-μl-Pipette aus dem Kultureinsatz. Lassen Sie eine dünne Schicht HBSS im Kultureinsatz, um das Explantat halbnass zu halten und eine Luft-Flüssig-Grenzfläche zu schaffen.
7. Inkubieren Sie die Hautexplantatkulturen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und 95 % Luft. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
   HINWEIS: Dieses Verfahren wurde veröffentlicht⁴. Dieses Kultursystem kann auch mit der Haut anderer Vögel wie Explantatkulturen aus Wachtel- oder Finkenhaut verwendet werden.

2. Epithel-mesenchymale Rekombination von Hühnerhaut (Abbildung 2)

1. Befruchtete Hühnereier werden in einem befeuchteten Inkubator bei 38 °C inkubiert und die Embryonen nach Hamburger und Hamilton¹⁴ (Abschnitt 1.1) in die Stadien gesetzt.
2. Bereiten Sie 2x calcium-magnesiumfreie (CMF) Kochsalzlösung mit 0,25% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Puffer vor.
   1. Stellen Sie 10x CMF-Puffer (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH₂PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH₂PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO₃ (0,12 M) 10 g, Glukose (0,1 M) 20 g in 1.000 mL destilliertem Wasser her. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein. Um 100 mL 2x CMF mit 0,25% EDTA-Puffer herzustellen, sollte das EDTA zuerst in 80 mL destilliertem Wasser aufgelöst werden, dann 20 mL 10x CMF-Puffer hinzufügen, um 2x CMF mit 0,25% EDTA-Arbeitslösung herzustellen.
3. Die Rückenhaut von Hühnerembryonen im Stadium 30-32 wird wie oben beschrieben (Abschnitt 1.2) in HBSS präpariert und in 2x CMF-Kochsalzlösung mit 0,25% EDTA auf Eis für 15-20 min inkubiert.
4. Trennen Sie Epithel und Mesenchym vorsichtig mit einer Uhrmacherzange. Übertragen Sie das getrennte Epithel und Mesenchym in eine saubere Schüssel, die HBSS enthält.
5. Kombinieren Sie das Epithel mit dem Mesenchym, indem Sie zuerst das Mesenchym auf eine Petrischale mit HBSS legen und dann das Epithel auf das Mesenchym legen. Platzieren Sie das Epithel entlang der gleichen anterior-posterioren Achse wie das Mesenchym oder drehen Sie das Epithel um 90^° von der anterior-posterioren Achse des Mesenchyms, um zu bestimmen, welche Komponente verschiedene Aspekte der Hautmorphogenese reguliert.
6. Übertragen Sie die rekombinierten Häute zum Wachstum in Kultureinsätze in 6-Well-Kulturschalen und entfernen Sie überschüssiges HBSS um die rekombinierte Haut.
7. Geben Sie 2 ml DMEM-Kulturmedium mit 10 % FBS in die Vertiefung außerhalb des Einsatzes. Platzieren Sie eine dünne Schicht DMEM in der Einsatzkammer, um das Explantat halbnass zu halten und eine Luft-Flüssig-Grenzfläche zu schaffen.
8. Die Hautrekombinanten werden bei 37 °C in einem Gemisch aus 5 % CO₂ und 95 % Luft inkubiert. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage. Dokumentieren Sie phänotypische Veränderungen in den ersten Hautphasen der Hautentwicklung mittels Zeitrafferfotografie mit einer Kamera, die an einem Präpariermikroskop montiert ist.
   HINWEIS: Dieses Verfahren wurde veröffentlicht¹¹.

3. Rekonstitution der Hühnerhaut (Abbildung 3)

1. Befruchtete Hühnereier werden in einem befeuchteten Inkubator bei 38 °C inkubiert und die Embryonen nach Hamburger und Hamilton¹⁴ (Abschnitt 1.1) in die Stadien gesetzt.
2. Präparieren Sie die Rückenhaut von Hühnerembryonen im Stadium 30-33 bei HBSS. Inkubieren Sie die Häute in 2x CMF-Kochsalzlösung mit 0,25% EDTA auf Eis für 15-20 min wie oben beschrieben (Abschnitt 2.3).
3. Trennen Sie Epithel und Mesenchym vorsichtig mit einer Uhrmacherzange. Übertragen Sie das getrennte Epithel und Mesenchym auf Eis auf HBSS.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Basalschicht des Epithels nicht zu beschädigen, wenn Sie das Epithel vom Mesenchym trennen.
4. Das abgetrennte Mesenchym in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auffangen und mit 0,1%iger Kollagenase/Trypsin-Lösung aus PBS in einem 37 °C warmen Wasserbad für 10-15 min inkubieren.
5. Dissoziieren Sie das Hautmesenchym mit einer Pasteurpipette, um eine einzellige Suspension herzustellen. Fügen Sie DMEM mit 10% FBS hinzu, um die Verdauung zu stoppen.
6. Pelletieren und zentrifugieren Sie die Zellen bei 233 × g für 5 min. Die Zellen wurden mit Kulturmedium in einer Konzentration von 2 × 10⁷ Zellen/ml resuspendiert.
   HINWEIS: In diesem Schritt können die mesenchymalen Zellen auch in virushaltigem Medium für 2-3 h auf Eis zur Gentransduktion resuspendiert werden.
7. Legen Sie einen Zellkultureinsatz in eine Vertiefung einer 6-Well-Schale. 10 μl von 2 × 10⁷ Zellen/ml mesenchymale Zellen auf den Gewebekultureinsatz geben. Geben Sie 2 ml DMEM-Kulturmedium mit 10 % FBS in die Vertiefung außerhalb des Einsatzes. Inkubieren Sie die plattierten mesenchymalen Zellen bei 37 °C mit einem Inkubator mit 5 % CO₂ und 95 % Luft für 1 h, damit sich die Zellen auf der Einlegemembran absetzen können.
8. Übertragen Sie das intakte Epithel mit einer 1-ml-Pipette auf das plattierte mesenchymale Tröpfchen, wobei die Epithel-Basalzellschicht den mesenchymalen Zellen zugewandt ist.
   HINWEIS: Bei der Übertragung von Epithel auf das mesenchymale Tröpfchen sollten die mesenchymalen Zellen nicht gestört werden.
9. Glätten Sie das intakte Epithel über dem Mesenchym, um die rekonstituierte Haut explantieren zu lassen. Lassen Sie eine dünne Schicht des Mediums auf dem Einsatz, um die rekonstituierte Haut halbnass zu halten und eine Luft-Flüssig-Grenzfläche zu schaffen. Das rekonstituierte Hautexplantat wird bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO₂ und 95 % Luft inkubiert. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
   HINWEIS: Dieses Verfahren wurde veröffentlicht¹³.

Ergebnisse

Explantationskulturen der Haut
Die Entwicklung von Federknospen aus ex vivo Hautorgankulturen kann direkt unter dem Mikroskop beobachtet werden. Unter Verwendung des Hautexplantationskulturmodells der Rückenhaut von Hühnern im Stadium 30 sind die Plakoden entlang der Mittellinie sichtbar. Die morphogenetische Front vermehrt sich dann allmählich lateral in Richtung Hautperipherie mit der Bildung neuer Federprimordien. Diese Federprimordien entwickeln sich nach 2 Tagen Kultur zu kurzen Feder...

Diskussion

Die Geweberekombination bietet einen Assay, um die einzigartigen Beiträge des Epithels und des Mesenchyms zu untersuchen. Bei Hühnern beginnen sich die Federn am Embryonaltag 7 (E7) zu entwickeln, während die Schuppen am E9 beginnen. Wenn das Mesenchym der E9-Schuppe mit dem Federepithel E7 rekombiniert wird, bildet das rekombinierte Gewebe Schuppen, und wenn das Mesenchym der E7-Feder mit dem Epithelfeder der E9-Schuppen rekombiniert wird, werden Federn gebildet¹¹. Diese Studien haben gezeigt,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042