Utilisation d’explants de peau aviaire pour étudier la structuration et l’organogenèse des tissus

Résumé

Nous décrivons ici des protocoles pour trois types de cultures d’explants de peau embryonnaire aviaire qui peuvent être utilisés pour examiner les interactions tissulaires, le film timelapse d’imagerie 4D (3D plus temps), la perturbation globale ou locale de la fonction moléculaire et la caractérisation de la biologie des systèmes.

Résumé

Le développement de la peau aviaire au cours de l’embryogenèse est un modèle unique qui peut fournir des informations précieuses sur la structure des tissus. Ici, trois variations sur les cultures d’explants de peau pour examiner différents aspects du développement de la peau sont décrites. Tout d’abord, les cultures et les manipulations d’organes ex vivo offrent aux chercheurs la possibilité d’observer et d’étudier directement le développement des bourgeons de plumes. La culture d’explants de peau peut croître pendant 7 jours, ce qui permet une analyse directe du comportement cellulaire et l’imagerie 4D à intervalles réguliers pendant cette période de croissance. Cela permet également des manipulations physiques et moléculaires des conditions de culture pour visualiser la réponse tissulaire. Par exemple, des billes enrobées de facteur de croissance peuvent être appliquées localement pour induire des changements dans le motif des plumes dans une zone limitée. Alternativement, la transduction virale peut être administrée à l’échelle mondiale dans les milieux de culture pour réguler à la hausse ou à la baisse l’expression des gènes. Deuxièmement, le protocole de recombinaison cutanée permet aux chercheurs d’étudier les interactions tissulaires entre l’épiderme et le mésenchyme qui proviennent de différentes régions de la peau, de différents stades de vie ou de différentes espèces. Cela offre l’occasion de tester la fenêtre temporelle dans laquelle l’épithélium est capable de répondre aux signaux et sa capacité à former différents appendices cutanés en réponse à des signaux provenant de différentes sources mésenchymateuses. Troisièmement, la reconstitution de la peau à l’aide de cellules dermiques dissociées recouvertes d’un épithélium intact réinitialise le développement de la peau et permet d’étudier les processus initiaux de structuration périodique. Cette approche améliore également notre capacité à manipuler l’expression des gènes entre les cellules dissociées avant de créer l’explant de peau reconstituée. Cet article présente les trois protocoles de culture et des expériences exemplaires pour démontrer leur utilité.

Introduction

Le développement de la peau de l’embryon aviaire est un excellent modèle pour étudier les mécanismes de la morphogenèse en raison des motifs distincts et de l’accessibilité à la microchirurgie et à la manipulation ^1,2. Cependant, l’évaluation des événements cellulaires et moléculaires dans les tissus intacts peut être difficile car la présence de tissus étrangers peut compliquer les observations microscopiques. De plus, la capacité de manipuler l’expression des gènes pour tester leur rôle dans la morphogenèse de la peau n’est pas toujours une tâche simple. Nous constatons que nous pouvons tester les fonctions ....

Protocole

1. Culture d’explants de peau de poulet (Figure 1)

1. Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur humidifié à 38 °C et les étaler selon Hamburger et Hamilton¹⁴.
   1. Au stade 28 (~E5.5), le deuxième doigt et le troisième orteil du membre sont plus longs que les autres ; Trois doigts et quatre orteils sont distincts.
   2. Au stade 29 (~E6), l’aile est pliée au niveau du coude ; Le deuxième doigt est nettement plus long que les autres.
   3. Au stade 30 (~E6.5), deux rangées de bourgeons plumaux dorsaux de chaque côté de la moelle épiniè....

Discussion

La recombinaison tissulaire permet d’explorer les contributions uniques de l’épithélium et du mésenchyme. Chez les poulets, les plumes commencent à se développer au jour embryonnaire 7 (E7) tandis que les écailles commencent à E9. Lorsque le mésenchyme de l’écaille E9 est recombiné avec l’épithélium de la plume E7, le tissu recombiné forme des écailles, et lorsque le mésenchyme de la plume E7 est recombiné avec l’épithélium de l’écaille E9, les plumes se forment¹¹. C.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042