Utilisation d’explants de peau aviaire pour étudier la structuration et l’organogenèse des tissus

Résumé

Nous décrivons ici des protocoles pour trois types de cultures d’explants de peau embryonnaire aviaire qui peuvent être utilisés pour examiner les interactions tissulaires, le film timelapse d’imagerie 4D (3D plus temps), la perturbation globale ou locale de la fonction moléculaire et la caractérisation de la biologie des systèmes.

Résumé

Le développement de la peau aviaire au cours de l’embryogenèse est un modèle unique qui peut fournir des informations précieuses sur la structure des tissus. Ici, trois variations sur les cultures d’explants de peau pour examiner différents aspects du développement de la peau sont décrites. Tout d’abord, les cultures et les manipulations d’organes ex vivo offrent aux chercheurs la possibilité d’observer et d’étudier directement le développement des bourgeons de plumes. La culture d’explants de peau peut croître pendant 7 jours, ce qui permet une analyse directe du comportement cellulaire et l’imagerie 4D à intervalles réguliers pendant cette période de croissance. Cela permet également des manipulations physiques et moléculaires des conditions de culture pour visualiser la réponse tissulaire. Par exemple, des billes enrobées de facteur de croissance peuvent être appliquées localement pour induire des changements dans le motif des plumes dans une zone limitée. Alternativement, la transduction virale peut être administrée à l’échelle mondiale dans les milieux de culture pour réguler à la hausse ou à la baisse l’expression des gènes. Deuxièmement, le protocole de recombinaison cutanée permet aux chercheurs d’étudier les interactions tissulaires entre l’épiderme et le mésenchyme qui proviennent de différentes régions de la peau, de différents stades de vie ou de différentes espèces. Cela offre l’occasion de tester la fenêtre temporelle dans laquelle l’épithélium est capable de répondre aux signaux et sa capacité à former différents appendices cutanés en réponse à des signaux provenant de différentes sources mésenchymateuses. Troisièmement, la reconstitution de la peau à l’aide de cellules dermiques dissociées recouvertes d’un épithélium intact réinitialise le développement de la peau et permet d’étudier les processus initiaux de structuration périodique. Cette approche améliore également notre capacité à manipuler l’expression des gènes entre les cellules dissociées avant de créer l’explant de peau reconstituée. Cet article présente les trois protocoles de culture et des expériences exemplaires pour démontrer leur utilité.

Introduction

Le développement de la peau de l’embryon aviaire est un excellent modèle pour étudier les mécanismes de la morphogenèse en raison des motifs distincts et de l’accessibilité à la microchirurgie et à la manipulation ^1,2. Cependant, l’évaluation des événements cellulaires et moléculaires dans les tissus intacts peut être difficile car la présence de tissus étrangers peut compliquer les observations microscopiques. De plus, la capacité de manipuler l’expression des gènes pour tester leur rôle dans la morphogenèse de la peau n’est pas toujours une tâche simple. Nous constatons que nous pouvons tester les fonctions des gènes en utilisant la transduction rétrovirale avec un taux de réussite plus élevé en utilisant des modèles d’explants de peau. Nous abordons ici les avantages de trois modèles d’explants de peau qui ont été développés.

La culture de peau embryonnaire aviaire est un système puissant pour évaluer le comportement cellulaire, la régulation des gènes et la fonction pendant le développement des bourgeons de plumes de la peau 3,4,5,6. Il permet d’évaluer les mécanismes moléculaires du développement des bourgeons de plumes par l’ajout global de facteurs de croissance placés dans le milieu de culture ou leur libération locale à partir de billes enrobées de facteurs de croissance. Les gènes régulateurs du développement peuvent également être manipulés à l’aide de la transduction de gènes viraux de formes négatives intactes ou dominantes pour des études fonctionnelles évaluant leurs rôles dans des événements morphogénétiques spécifiques ^7,8.

La culture de recombinaison épithélio-mésenchymateuse aviaire permet aux chercheurs de déterminer les contributions de chaque composant de la peau au cours des premiers stades de la morphogenèse de la peau. L’utilisation de cette approche par Rawles a révélé que les interactions entre le mésenchyme et l’épithélium sont essentielles à la formation des appendices cutanés⁹. Le mésenchyme peut former des condensations et l’épithélium est nécessaire pour induire et maintenir les formations de condensation mésenchymateuse². Plus tard, cette approche a été utilisée pour évaluer pourquoi les poulets sans écailles ne forment pas de plumes. On a découvert que le défaut se trouvait dans le mésenchyme¹⁰. Dhouailly a réalisé des études de recombinaison épithélio-mésenchymateuse tissulaire chez des embryons d’espèces différentes. Ces études ont fourni des informations développementales et évolutives sur les communications épithéliales-mésenchymateuses qui favorisent la morphogenèse de la peau³.

Cette étude a été utilisée pour mieux comprendre les facteurs qui contrôlent la croissance des plumes. La méthode améliore également la visualisation des événements cellulaires et moléculaires impliqués dans la structuration de la peau qui se produisent lors de l’initiation, du développement et de l’allongement des plumes le long de l’axe antéro-postérieur. Lorsque l’épithélium est séparé du mésenchyme et que les deux composants sont ensuite recombinés, de nouvelles interactions rétablissent le modelage de la peau. Cette approche nous permet d’évaluer les signaux inducteurs mésenchymateux et les molécules de compétence épithéliale qui permettent à l’épiderme de répondre aux signaux mésenchymateux¹¹. L’expression moléculaire ultérieure en aval qui est nécessaire au développement des bourgeons de plumes et à la formation de motifs peut également être examinée. Ces études ont établi que l’emplacement des bourgeons est contrôlé par le mésenchyme. La rotation de l’épithélium de 90^° avant la recombinaison avec le mésenchyme démontre que la direction de l’allongement du bourgeon de plume est contrôlée par l’épithélium. Cette méthode était essentielle pour nous permettre d’étudier le mécanisme moléculaire régulant l’orientation des bourgeons de plumes¹².

La culture de reconstitution de la peau aviaire, dans laquelle le mésenchyme cutané est dissocié en cellules uniques avant d’être plaqué à haute densité cellulaire et recouvert d’un épithélium intact, réinitialise les cellules dermiques à un état primordial. L’explant s’auto-organise alors pour former un nouveau motif périodique indépendant des indices précédents¹³. Ce modèle de reconstitution cutanée peut être utilisé pour étudier les processus initiaux de la structuration périodique des plumes. Nous avons utilisé cette approche pour explorer comment la modulation du rapport entre les cellules mésenchymateuses et un seul morceau d’épithélium peut influencer la taille ou le nombre de bourgeons de plumes. On a constaté que le nombre de bourgeons augmentait, mais pas la taille des bourgeons, car le rapport des cellules mésenchymateuses augmentait. Un autre avantage de cette approche est que la transduction virale des cellules mésenchymateuses montre une efficacité plus élevée que dans les deux autres conditions de culture et peut produire des phénotypes plus évidents.

Protocole

1. Culture d’explants de peau de poulet (Figure 1)

1. Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur humidifié à 38 °C et les étaler selon Hamburger et Hamilton¹⁴.
   1. Au stade 28 (~E5.5), le deuxième doigt et le troisième orteil du membre sont plus longs que les autres ; Trois doigts et quatre orteils sont distincts.
   2. Au stade 29 (~E6), l’aile est pliée au niveau du coude ; Le deuxième doigt est nettement plus long que les autres.
   3. Au stade 30 (~E6.5), deux rangées de bourgeons plumaux dorsaux de chaque côté de la moelle épinière sont visibles au niveau brachial et trois rangées sont visibles au niveau des pattes.
   4. Au stade 31 (~E7), il y a ~7 rangées de plumes aux niveaux jumbo-sacrés.
   5. Au stade 32, onze rangées ou plus de bourgeons de plumes sont présentes au niveau des pattes.
2. Placez un embryon de poulet de stade 28 à 32 dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant une solution saline tamponnée de Hanks (HBSS) ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   1. Disséquez la peau dorsale de l’embryon entre le bas du cou et la région de la queue. Utilisez des ciseaux pour retirer la tête du cou. Tirez doucement sur les bourgeons des membres pour positionner la face ventrale du corps vers le bas, les appendices s’étendant vers l’extérieur.
   2. Faites une incision de l’avant vers l’arrière de la peau le long des deux côtés latéraux du corps de l’embryon à l’aide d’une pince d’horloger ou de ciseaux à ressort tranchants. Assurez-vous de stabiliser le corps avec une paire de pinces en pinçant les bourgeons des membres longitudinalement. Pelez doucement la peau du cou vers la région de la queue ou de la queue vers le cou à l’aide d’une pince d’horloger.
3. Retirez délicatement les tissus sous-cutanés qui restent attachés à la peau pelée et lissez les bords de la peau avec les ciseaux à ressort tranchants.
4. Ajouter 2 mL/puits de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et une solution de pénicilline/streptomycine (diluée 1:100) dans un puits dans une boîte à 6 puits. Une fois que le milieu et les antibiotiques ont été ajoutés, placez un insert de culture tissulaire stérile à l’intérieur du puits, de sorte que le milieu se trouve à l’extérieur de l’insert de culture.
5. Transférez la peau à l’aide d’une spatule dans l’insert de culture, l’épiderme vers le haut et le mésenchyme vers le bas sur la membrane de l’insert. Pour vous assurer que la peau repose à plat sans aucun pli, tirez la peau sur la spatule en HBSS. Faites glisser la peau de la spatule avec le liquide pour faciliter le transfert de la peau sans plier.
6. Retirez l’excès de HBSS de l’insert de culture à l’aide d’une pipette de 200 μL. Laissez une fine couche de HBSS à l’intérieur de l’insert de culture pour maintenir l’explant semi-humide afin de fournir une interface air-liquide.
7. Incuber les cultures d’explants de peau à 37 °C en utilisant 5 % de CO₂ et 95 % d’air. Changez de milieu tous les 2 jours.
   REMARQUE : Cette procédure a été publiée⁴. Ce système de culture peut également être utilisé avec la peau d’autres oiseaux tels que les cultures d’explants de peau de caille ou de pinson.

2. Recombinaison épithéliale-mésenchymateuse de la peau de poulet (Figure 2)

1. Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur humidifié à 38 °C et stadifier les embryons selon Hamburger et Hamilton¹⁴ (section 1.1).
2. Préparez 2 solutions salines sans calcium-magnésium (CMF) avec un tampon d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 %.
   1. Préparez 10 tampons CMF (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH₂PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH₂PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO₃ (0,12 M) 10 g, glucose (0,1 M) 20 g dans 1 000 mL d’eau distillée. Ajustez le pH à 7,3. Pour faire 100 ml de 2x CMF avec 0,25% de tampon EDTA, l’EDTA doit d’abord être dissous dans 80 mL d’eau distillée, puis ajouter 20 mL de 10x tampon CMF pour faire 2x CMF avec 0,25% de solution de travail EDTA.
3. Disséquez les peaux dorsales d’embryons de poulet de stade 30 à 32 dans HBSS comme décrit ci-dessus (section 1.2) et incubez-les dans 2 doses de solution saline CMF avec 0,25 % d’EDTA sur de la glace pendant 15 à 20 min.
4. Séparez soigneusement l’épithélium et le mésenchyme à l’aide d’une pince d’horloger. Transférez l’épithélium et le mésenchyme séparés dans une boîte propre contenant du HBSS.
5. Recombinez l’épithélium avec le mésenchyme en plaçant d’abord le mésenchyme sur une boîte de Pétri contenant HBSS, puis placez l’épithélium sur le mésenchyme. Placez l’épithélium le long du même axe antéro-postérieur que le mésenchyme ou tournez l’épithélium de 90^o par rapport à l’axe antéro-postérieur du mésenchyme pour déterminer quel composant régule différents aspects de la morphogenèse de la peau.
6. Transférez les peaux recombinées dans des inserts de culture dans des boîtes de culture à 6 puits pour la croissance et retirez l’excès de HBSS autour de la peau recombinée.
7. Placez 2 ml de milieu de culture DMEM avec 10 % de FBS dans le puits à l’extérieur de l’insert. Placez une fine couche de DMEM à l’intérieur de la chambre d’insertion pour maintenir l’explant semi-humide afin de fournir une interface air-liquide.
8. Incuber les recombinants cutanés à 37 °C dans un mélange de 5% de CO₂ et de 95% d’air. Changez de milieu tous les 2 jours. Documentez les changements phénotypiques dans les phases initiales du développement cutané à l’aide de photographies en accéléré avec un appareil photo monté sur un microscope à dissection.
   REMARQUE : Cette procédure a été publiée¹¹.

3. Reconstitution de la peau de poulet (Figure 3)

1. Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur humidifié à 38 °C et stadifier les embryons selon Hamburger et Hamilton¹⁴ (section 1.1).
2. Disséquer les peaux dorsales d’embryons de poulet de stade 30-33 dans HBSS. Incuber les peaux dans 2 solutions salines CMF avec 0,25 % d’EDTA sur de la glace pendant 15 à 20 minutes comme décrit ci-dessus (section 2.3).
3. Séparez soigneusement l’épithélium et le mésenchyme à l’aide d’une pince d’horloger. Transférez l’épithélium et le mésenchyme séparés dans HBSS sur de la glace.
   REMARQUE : Veillez à ne pas endommager la couche basale de l’épithélium lorsque vous séparez l’épithélium du mésenchyme.
4. Prélever le mésenchyme séparé dans un tube à centrifuger de 15 mL et incuber avec une solution de collagénase/trypsine à 0,1 % de PBS dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 à 15 min.
5. Dissocier le mésenchyme cutané à l’aide d’une pipette Pasteur pour obtenir une suspension unicellulaire. Ajoutez du DMEM avec 10% de FBS pour arrêter la digestion.
6. Granulez et centrifugez les cellules à 233 × g pendant 5 min. Remise en suspension des cellules avec un milieu de culture à une concentration de 2 × 10⁷ cellules/mL.
   REMARQUE : À cette étape, les cellules mésenchymateuses peuvent également être remises en suspension dans un milieu contenant le virus pendant 2 à 3 h sur de la glace pour la transduction génique.
7. Placez un insert de culture cellulaire dans un puits d’une boîte à 6 puits. Déposez 10 μL de 2 × 10 cellules mésenchymateuses de⁷ cellules/mL sur l’insert de culture tissulaire. Placez 2 ml de milieu de culture DMEM avec 10 % de FBS dans le puits à l’extérieur de l’insert. Incuber les cellules mésenchymateuses en plaque à 37 °C à l’aide d’un incubateur à 5 % de CO₂ et à 95 % d’air pendant 1 h pour permettre aux cellules de se fixer sur la membrane d’insertion.
8. Transférez l’épithélium intact sur la gouttelette mésenchymateuse plaquée avec la couche de cellules basales de l’épithélium face aux cellules mésenchymateuses à l’aide d’une pipette de 1 mL.
   REMARQUE : Lors du transfert de l’épithélium dans la gouttelette mésenchymateuse, les cellules mésenchymateuses ne doivent pas être perturbées.
9. Aplatir l’épithélium intact sur le mésenchyme pour faire explanter la peau reconstituée. Laissez une fine couche du milieu sur l’insert pour maintenir l’explant de peau reconstituée semi-humide afin de fournir une interface air-liquide. Incuber l’explant de peau reconstituée à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ et 95 % d’air. Changez de milieu tous les 2 jours.
   REMARQUE : Cette procédure a été publiée¹³.

Résultats

Cultures d’explants de peau
Le développement des bourgeons de plumes à partir de cultures d’organes cutanés ex vivo peut être observé directement au microscope. À l’aide du modèle de culture d’explants de peau de poulet de stade 30, les placodes sont visibles le long de la ligne médiane. Le front morphogénétique se propage ensuite progressivement latéralement vers la périphérie de la peau avec la formation de nouvelles primordiums de plumes. Ces primordia à plumes se tra...

Discussion

La recombinaison tissulaire permet d’explorer les contributions uniques de l’épithélium et du mésenchyme. Chez les poulets, les plumes commencent à se développer au jour embryonnaire 7 (E7) tandis que les écailles commencent à E9. Lorsque le mésenchyme de l’écaille E9 est recombiné avec l’épithélium de la plume E7, le tissu recombiné forme des écailles, et lorsque le mésenchyme de la plume E7 est recombiné avec l’épithélium de l’écaille E9, les plumes se forment¹¹. C...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042