Usando explantes de pele aviária para estudar padrões de tecidos e organogênese

Resumo

Aqui, descrevemos protocolos para três tipos de culturas de explantes de pele embrionária aviária que podem ser usados para examinar interações teciduais, filme de lapso de tempo de imagem 4D (3D mais tempo), perturbação global ou local da função molecular e caracterização de biologia de sistemas.

Resumo

A pele aviária em desenvolvimento durante a embriogênese é um modelo único que pode fornecer informações valiosas sobre a padronização do tecido. Aqui, são descritas três variações nas culturas de explantes cutâneos para examinar diferentes aspectos do desenvolvimento da pele. Primeiro, culturas e manipulações de órgãos ex vivo oferecem aos pesquisadores oportunidades de observar e estudar diretamente o desenvolvimento de botões de penas. A cultura de explante cutâneo pode crescer por 7 dias, permitindo a análise direta do comportamento celular e imagens 4D em intervalos durante esse período de crescimento. Isso também permite manipulações físicas e moleculares das condições de cultura para visualizar a resposta do tecido. Por exemplo, contas revestidas com fator de crescimento podem ser aplicadas localmente para induzir mudanças no padrão de penas em uma área limitada. Alternativamente, a transdução viral pode ser entregue globalmente nos meios de cultura para aumentar ou diminuir a expressão gênica. Em segundo lugar, o protocolo de recombinação da pele permite que os pesquisadores investiguem as interações teciduais entre a epiderme e o mesênquima que são derivadas de diferentes regiões da pele, diferentes estágios de vida ou diferentes espécies. Isso oferece uma oportunidade de testar a janela de tempo na qual o epitélio é competente para responder a sinais e sua capacidade de formar diferentes apêndices cutâneos em resposta a sinais de diferentes fontes mesenquimais. Em terceiro lugar, a reconstituição da pele usando células dérmicas dissociadas revestidas com epitélio intacto redefine o desenvolvimento da pele e permite o estudo dos processos iniciais de padronização periódica. Essa abordagem também aumenta nossa capacidade de manipular a expressão gênica entre as células dissociadas antes de criar o explante de pele reconstituído. Este artigo fornece os três protocolos de cultura e experimentos exemplares para demonstrar sua utilidade.

Introdução

O desenvolvimento da pele do embrião aviário é um excelente modelo para estudar os mecanismos da morfogênese devido aos padrões distintos e à acessibilidade à microcirurgia e manipulação ^1,2. No entanto, avaliar eventos celulares e moleculares em tecidos intactos pode ser difícil porque a presença de tecidos estranhos pode complicar as observações microscópicas. Além disso, a capacidade de manipular a expressão gênica para testar seu papel na morfogênese da pele nem sempre é uma tarefa simples. Descobrimos que podemos testar as funções dos genes usando transdução retroviral com uma taxa de sucesso mais alta usando modelos de explante de pele. Aqui discutimos as vantagens de três modelos de explante de pele que foram desenvolvidos.

A cultura da pele embrionária aviária é um sistema poderoso para avaliar o comportamento celular, a regulação gênica e a função durante o desenvolvimento dos botões das penas da pele 3,4,5,6. Permite a avaliação dos mecanismos moleculares do desenvolvimento dos botões de penas através da adição global de fatores de crescimento colocados nos meios de cultura ou sua liberação local de grânulos revestidos com fator de crescimento. Os genes reguladores do desenvolvimento também podem ser manipulados usando a transdução de genes virais de formas negativas intactas ou dominantes para estudos funcionais que avaliam seus papéis em eventos morfogenéticos específicos ^7,8.

A cultura de recombinação epitelial-mesenquimal aviária permite que os investigadores determinem as contribuições de cada componente da pele durante os estágios iniciais da morfogênese da pele. O uso dessa abordagem por Rawles revelou que as interações entre o mesênquima e o epitélio são essenciais para a formação de apêndices cutâneos⁹. O mesênquima pode formar condensações e o epitélio é necessário para induzir e manter as formações de condensação mesenquimal². Mais tarde, essa abordagem foi usada para avaliar por que as galinhas sem escamas não conseguem formar penas. Descobriu-se que o defeito estava no mesênquima¹⁰. Dhouailly realizou estudos de recombinação epitelial-mesenquimal tecidual em embriões de diferentes espécies. Esses estudos forneceram insights evolutivos e de desenvolvimento sobre as comunicações epitelial-mesenquimais que promovem a morfogênese da pele³.

Este estudo foi usado para entender melhor os fatores que controlam o crescimento das penas. O método também melhora a visualização de eventos celulares e moleculares envolvidos na padronização da pele que ocorrem durante a iniciação, desenvolvimento e alongamento das penas ao longo do eixo ântero-posterior. Quando o epitélio é separado do mesênquima e os dois componentes são recombinados, novas interações restabelecem o padrão da pele. Essa abordagem permite avaliar os sinais indutores mesenquimais e as moléculas de competência epitelial que permitem que a epiderme responda aos sinais mesenquimais¹¹. A expressão molecular subsequente a jusante necessária para o desenvolvimento do botão de penas e a formação de padrões também pode ser examinada. Esses estudos estabeleceram que a localização dos botões é controlada pelo mesênquima. A rotação do epitélio 90^o antes da recombinação com o mesênquima demonstra que a direção do alongamento do botão da pena é controlada pelo epitélio. Este método foi essencial para estudarmos o mecanismo molecular que regula a orientação dos botões das penas¹².

A cultura de reconstituição da pele aviária, na qual o mesênquima da pele é dissociado em células únicas antes de ser plaqueado em alta densidade celular e revestido com epitélio intacto, redefine as células dérmicas a um estado primordial. O explante então se auto-organiza para formar um novo padrão periódico independente das pistas anteriores¹³. Este modelo de reconstituição da pele pode ser usado para estudar os processos iniciais de padronização periódica de penas. Usamos essa abordagem para explorar como a modulação da proporção de células mesenquimais para um único pedaço de epitélio pode influenciar o tamanho ou o número de botões de penas. Verificou-se que o número de gemas aumentou, mas não o tamanho das gemas, à medida que a proporção de células mesenquimais aumentou. Outra vantagem dessa abordagem é que a transdução viral de células mesenquimais mostra maior eficiência do que nas outras duas condições de cultura e pode produzir fenótipos mais óbvios.

Protocolo

1. Cultura de explante de pele de galinha (Figura 1)

1. Incubar ovos de galinha fertilizados em uma incubadora umidificada a 38 ° C e estabelecê-los de acordo com Hamburger e Hamilton¹⁴.
   1. No estágio 28 (~E5.5), o segundo dedo do membro e o terceiro dedo do pé são mais longos que os outros; três dígitos e quatro dedos são distintos.
   2. No estágio 29 (~E6), a asa é dobrada no cotovelo; O segundo dígito é distintamente mais longo do que os outros.
   3. No estágio 30 (~ E6.5), duas fileiras de botões de penas dorsais de cada lado da medula espinhal são visíveis no nível braquial e três fileiras são vistas no nível das pernas.
   4. No estágio 31 (~ E7), existem ~ 7 fileiras de penas nos níveis jumbo-sacral.
   5. No estágio 32, onze ou mais fileiras de botões de penas estão presentes ao nível das pernas.
2. Coloque um embrião de galinha estágio 28-32 em uma placa de Petri de 60 mm contendo solução salina tamponada de Hanks (HBSS) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   1. Disseque a pele dorsal do embrião entre a parte inferior do pescoço e a região da cauda. Use uma tesoura para remover a cabeça do pescoço. Puxe suavemente os botões dos membros para posicionar o lado ventral do corpo para baixo com os apêndices se espalhando para fora.
   2. Faça uma incisão anterior a posterior na pele ao longo dos dois lados laterais do corpo embrionário usando uma pinça de relojoeiro ou uma tesoura afiada. Certifique-se de estabilizar o corpo com uma pinça, beliscando os botões dos membros longitudinalmente. Descasque suavemente a pele do pescoço até a região da cauda ou da cauda até o pescoço usando uma pinça de relojoeiro.
3. Remova suavemente os tecidos subcutâneos que permanecem presos à pele descascada e alise as bordas da pele com a tesoura afiada de mola.
4. Adicione 2 mL / poço de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e solução de penicilina / estreptomicina (diluída 1:100) a um poço em um prato de 6 poços. Uma vez que o meio e os antibióticos tenham sido adicionados, coloque uma inserção de cultura de tecido estéril dentro do poço, de modo que a mídia fique na parte externa da inserção de cultura.
5. Transfira a pele com uma espátula para a inserção da cultura com a epiderme voltada para cima e o mesênquima voltado para baixo na membrana da inserção. Para garantir que a pele fique plana sem vincos, puxe a pele para a espátula em HBSS. Deslize a pele da espátula com o líquido para facilitar a transferência da pele sem dobrar.
6. Remova o excesso de HBSS do inserto de cultura com uma pipeta de 200 μL. Deixe uma fina camada de HBSS dentro do inserto de cultura para manter o explante semi-úmido para fornecer uma interface ar-líquido.
7. Incubar as culturas de explantes cutâneos a 37 °C utilizando 5% de CO₂ e 95% de ar. Troque o meio a cada 2 dias.
   NOTA: Este procedimento foi publicado⁴. Este sistema de cultura também pode ser usado com a pele de outras aves, como culturas de explante de pele de codorna ou tentilhão.

2. Recombinação epitelial-mesenquimal da pele de galinha (Figura 2)

1. Incubar ovos de galinha fertilizados em uma incubadora umidificada a 38 ° C e estadiar os embriões de acordo com Hamburger e Hamilton¹⁴ (seção 1.1).
2. Prepare 2x solução salina livre de cálcio e magnésio (CMF) com tampão de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25%.
   1. Faça 10x tampão CMF (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH₂PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH₂PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO₃ (0,12 M) 10 g, glicose (0,1 M) 20 g em 1.000 mL de água destilada. Ajuste o pH para 7,3. Para fazer 100 mL de 2x CMF com tampão EDTA a 0,25%, o EDTA deve ser dissolvido em 80 mL de água destilada primeiro e, em seguida, adicionar 20 mL de tampão CMF 10x para fazer 2x CMF com solução de trabalho EDTA a 0,25%.
3. Dissecar as peles dorsais do embrião de galinha estágio 30-32 em HBSS conforme descrito acima (seção 1.2) e incubá-las em solução salina 2x CMF com 0,25% de EDTA em gelo por 15-20 min.
4. Separe cuidadosamente o epitélio e o mesênquima usando uma pinça de relojoeiro. Transfira o epitélio e o mesênquima separados para um prato limpo contendo HBSS.
5. Recombine o epitélio com o mesênquima, colocando primeiro o mesênquima em uma placa de Petri contendo HBSS e, em seguida, coloque o epitélio em cima do mesênquima. Coloque o epitélio ao longo do mesmo eixo ântero-posterior do mesênquima ou gire o epitélio 90o^{do eixo} ântero-posterior do mesênquima para determinar qual componente regula diferentes aspectos da morfogênese da pele.
6. Transfira as peles recombinadas para inserções de cultura em placas de cultura de 6 poços para crescimento e remova o excesso de HBSS ao redor da pele recombinada.
7. Coloque 2 mL de meio de cultura DMEM com 10% de FBS no poço fora da inserção. Coloque uma fina camada de DMEM dentro da câmara de inserção para manter o explante semi-úmido para fornecer uma interface ar-líquido.
8. Incubar os recombinantes cutâneos a 37 °C numa mistura de 5% de CO₂ e 95% de ar. Troque o meio a cada 2 dias. Documente as mudanças fenotípicas nas fases iniciais do desenvolvimento da pele usando fotografia de lapso de tempo com uma câmera montada em um microscópio de dissecação.
   NOTA: Este procedimento foi publicado¹¹.

3. Reconstituição da pele de frango (Figura 3)

1. Incubar ovos de galinha fertilizados em uma incubadora umidificada a 38 ° C e estadiar os embriões de acordo com Hamburger e Hamilton¹⁴ (seção 1.1).
2. Dissecar as peles dorsais do embrião de galinha estágio 30-33 em HBSS. Incube as peles em solução salina 2x CMF com 0,25% de EDTA no gelo por 15-20 min, conforme descrito acima (seção 2.3).
3. Separe cuidadosamente o epitélio e o mesênquima usando uma pinça de relojoeiro. Transfira o epitélio e o mesênquima separados para HBSS no gelo.
   NOTA: Tenha cuidado para não danificar a camada basal do epitélio ao separar o epitélio do mesênquima.
4. Colete o mesênquima separado em um tubo de centrífuga de 15 mL e incube com solução de colagenase / tripsina a 0,1% feita em PBS em banho-maria a 37 ° C por 10-15 min.
5. Dissocie o mesênquima da pele com uma pipeta de Pasteur para fazer uma suspensão unicelular. Adicione DMEM com 10% de FBS para interromper a digestão.
6. Pulverize e centrifugue as células a 233 × g durante 5 min. Ressuspendeu as células com meio de cultura na concentração de 2 × 10⁷ células/mL.
   NOTA: Nesta etapa, as células mesenquimais também podem ser ressuspensas em meio contendo vírus por 2-3 h em gelo para transdução gênica.
7. Coloque uma inserção de cultura de células em um poço de um prato de 6 poços. Solte 10 μL de 2 × 10⁷ células/mL de células mesenquimais no inserto de cultura de tecidos. Coloque 2 ml de meio de cultura DMEM com 10% de FBS no poço fora da inserção. Incubar as células mesenquimais plaqueadas a 37 °C utilizando uma incubadora de ar a 5% de CO₂ e a 95% durante 1 h para permitir que as células se depositem na membrana de inserção.
8. Transfira o epitélio intacto para cima da gotícula mesenquimal plaqueada com a camada de células basais do epitélio voltada para as células mesenquimais usando uma pipeta de 1 mL.
   NOTA: Ao transferir o epitélio para a gotícula mesenquimal, as células mesenquimais não devem ser perturbadas.
9. Achate o epitélio intacto sobre o mesênquima para fazer o explante de pele reconstituída. Deixe uma fina camada do meio na inserção para manter o explante de pele reconstituída semi-úmido para fornecer uma interface ar-líquido. Incubar o explante cutâneo reconstituído a 37 °C numa incubadora de ar a 5% de CO₂ e 95%. Troque o meio a cada 2 dias.
   NOTA: Este procedimento foi publicado¹³.

Resultados

Culturas de explante cutâneo
O desenvolvimento de botões de penas de culturas de órgãos da pele ex vivo pode ser observado diretamente ao microscópio. Usando o modelo de cultura de explante de pele da pele dorsal do estágio 30 de frango, os placódios são visíveis ao longo da linha média. A frente morfogenética então se propaga gradualmente lateralmente em direção à periferia da pele com a formação de novos primórdios de penas. Esses primórdios de penas se desenvolverão em ...

Discussão

A recombinação tecidual fornece um ensaio para explorar as contribuições únicas do epitélio e do mesênquima. Nas galinhas, as penas começam a se desenvolver no dia embrionário 7 (E7), enquanto as escamas começam no E9. Quando o mesênquima de escamas E9 é recombinado com o epitélio de penas E7, o tecido recombinado forma escamas, e quando o mesênquima de penas E7 é recombinado com o epitélio de escamas E9, as penas são formadas¹¹. Esses estudos demonstraram que o mesênquima contro...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042