Uso de explantes de piel de ave para estudiar el patrón de tejidos y la organogénesis

Resumen

Aquí describimos los protocolos para tres tipos de cultivos de explantes de piel embrionaria aviar que se pueden utilizar para examinar las interacciones de los tejidos, la película de lapso de tiempo de imágenes 4D (3D más tiempo), la perturbación global o local de la función molecular y la caracterización de la biología de sistemas.

Resumen

El desarrollo de la piel aviar durante la embriogénesis es un modelo único que puede proporcionar información valiosa sobre el patrón de los tejidos. Aquí se describen tres variaciones de los cultivos de explantes cutáneos para examinar diferentes aspectos del desarrollo de la piel. En primer lugar, los cultivos y manipulaciones de órganos ex vivo ofrecen a los investigadores la oportunidad de observar y estudiar directamente el desarrollo de las yemas de las plumas. El cultivo de explantes de piel puede crecer durante 7 días, lo que permite el análisis directo del comportamiento celular y la obtención de imágenes 4D a intervalos durante este período de crecimiento. Esto también permite manipulaciones físicas y moleculares de las condiciones de cultivo para visualizar la respuesta de los tejidos. Por ejemplo, las cuentas recubiertas con factor de crecimiento se pueden aplicar localmente para inducir cambios en el patrón de las plumas en un área limitada. Alternativamente, la transducción viral puede administrarse globalmente en los medios de cultivo para aumentar o disminuir la expresión génica. En segundo lugar, el protocolo de recombinación de piel permite a los investigadores investigar las interacciones de los tejidos entre la epidermis y el mesénquima que se derivan de diferentes regiones de la piel, diferentes etapas de la vida o diferentes especies. Esto brinda la oportunidad de probar la ventana de tiempo en la que el epitelio es competente para responder a las señales y su capacidad para formar diferentes apéndices de la piel en respuesta a señales de diferentes fuentes mesenquimales. En tercer lugar, la reconstitución de la piel mediante el uso de células dérmicas disociadas superpuestas con epitelio intacto restablece el desarrollo de la piel y permite el estudio de los procesos iniciales de patrones periódicos. Este enfoque también mejora nuestra capacidad para manipular la expresión génica entre las células disociadas antes de crear el explante de piel reconstituido. Este artículo proporciona los tres protocolos de cultivo y experimentos ejemplares para demostrar su utilidad.

Introducción

El desarrollo de la piel del embrión aviar es un excelente modelo para estudiar los mecanismos de morfogénesis debido a los distintos patrones y la accesibilidad a la microcirugía y la manipulación ^1,2. Sin embargo, la evaluación de eventos celulares y moleculares en tejidos intactos puede ser difícil porque la presencia de tejidos extraños puede complicar las observaciones microscópicas. Además, la capacidad de manipular la expresión génica para probar su papel en la morfogénesis de la piel no siempre es una tarea sencilla. Descubrimos que podemos probar las funciones de los genes mediante la transducción retroviral con una mayor tasa de éxito utilizando modelos de explantes de piel. Aquí discutimos las ventajas de tres modelos de explantes de piel que se han desarrollado.

El cultivo de piel embrionaria aviar es un poderoso sistema para evaluar el comportamiento celular, la regulación génica y la función durante el desarrollo de las yemas de las plumas de la piel 3,4,5,6. Permite la evaluación de los mecanismos moleculares del desarrollo de las yemas de las plumas a través de la adición global de factores de crecimiento colocados en los medios de cultivo o su liberación local a partir de perlas recubiertas de factores de crecimiento. Los genes reguladores del desarrollo también pueden manipularse utilizando la transducción de genes virales de formas negativas intactas o dominantes para estudios funcionales que evalúan su papel en eventos morfogenéticos específicos ^7,8.

El cultivo de recombinación epitelio-mesenquimal aviar permite a los investigadores determinar las contribuciones de cada componente de la piel durante las primeras etapas de la morfogénesis de la piel. El uso de este enfoque por parte de Rawles reveló que las interacciones entre el mesénquima y el epitelio son esenciales para la formación de apéndices^{cutáneos 9}. El mesénquima puede formar condensaciones y el epitelio es necesario para inducir y mantener las formaciones de condensación mesenquimal². Más tarde, este enfoque se utilizó para evaluar por qué los pollos sin escamas no logran formar plumas. Se descubrió que el defecto estaba en el mesénquima¹⁰. Dhouailly realizó estudios de recombinación epitelio-mesenquimal tisular en embriones de diferentes especies. Estos estudios proporcionaron información sobre el desarrollo y la evolución de las comunicaciones epitelio-mesenquimales que promueven la morfogénesis de la piel³.

Este estudio se utilizó para comprender mejor los factores que controlan el crecimiento de las plumas. El método también mejora la visualización de los eventos celulares y moleculares involucrados en el modelado de la piel que tienen lugar durante la iniciación, el desarrollo y el alargamiento de las plumas a lo largo del eje antero-posterior. Cuando el epitelio se separa del mesénquima y los dos componentes se recombinan, las nuevas interacciones restablecen el patrón de la piel. Este enfoque nos permite evaluar las señales inductoras mesenquimales y las moléculas de competencia epitelial que permiten a la epidermis responder a las señales mesenquimales¹¹. También se puede examinar la expresión molecular posterior que se requiere para el desarrollo de las yemas de las plumas y la formación de patrones. Estos estudios han establecido que la ubicación de las yemas está controlada por el mesénquima. La rotación del epitelio 90^o antes de la recombinación con el mesénquima demuestra que la dirección de la elongación de la yema de la pluma está controlada por el epitelio. Este método fue esencial para estudiar el mecanismo molecular que regula la orientación de las yemas de las plumas¹².

El cultivo de reconstitución de la piel aviar, en el que el mesénquima de la piel se disocia en células individuales antes de la siembra a alta densidad celular y se superpone con epitelio intacto, restablece las células dérmicas a un estado primordial. A continuación, el explante se autoorganiza para formar un nuevo patrón periódico independiente de las señales anteriores¹³. Este modelo de reconstitución de la piel se puede utilizar para estudiar los procesos iniciales del patrón periódico de las plumas. Utilizamos este enfoque para explorar cómo la modulación de la proporción de células mesenquimales por una sola pieza de epitelio puede influir en el tamaño o el número de yemas de plumas. Se encontró que el número de yemas aumentaba, pero no el tamaño de las yemas, ya que aumentaba la proporción de células mesenquimales. Otra ventaja de este enfoque es que la transducción viral de células mesenquimales muestra una mayor eficiencia que en las otras dos condiciones de cultivo y puede producir fenotipos más obvios.

Protocolo

1. Cultivo de explantes de piel de pollo (Figura 1)

1. Incubar los huevos de gallina fertilizados en una incubadora humidificada a 38 °C y escalonarlos de acuerdo con Hamburger y Hamilton¹⁴.
   1. En la etapa 28 (~E5.5), el segundo dedo y el tercer dedo de la extremidad son más largos que los demás; Tres dedos y cuatro dedos son distintos.
   2. En la etapa 29 (~E6), el ala se dobla a la altura del codo; El segundo dígito es claramente más largo que los demás.
   3. En la etapa 30 (~E6.5), dos filas de yemas de plumas dorsales a cada lado de la médula espinal son visibles a nivel braquial y tres filas se ven a nivel de las piernas.
   4. En la etapa 31 (~E7), hay ~7 filas de plumas en los niveles jumbo-sacros.
   5. En la etapa 32, once o más filas de yemas de plumas están presentes a nivel de las patas.
2. Coloque un embrión de pollo de etapa 28-32 en una placa de Petri de 60 mm que contenga solución salina tamponada de Hanks (HBSS) o solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   1. Disecciona la piel dorsal del embrión entre la parte inferior del cuello y la región de la cola. Usa unas tijeras para separar la cabeza del cuello. Tire suavemente de las yemas de las extremidades para colocar el lado ventral del cuerpo hacia abajo con los apéndices extendidos hacia afuera.
   2. Haga una incisión anterior a posterior en la piel a lo largo de los dos lados flanqueantes del cuerpo del embrión con pinzas de relojero o tijeras de resorte afiladas. Asegúrese de estabilizar el cuerpo con un par de pinzas pellizcando las yemas de las extremidades longitudinalmente. Pele suavemente la piel desde el cuello hasta la región de la cola o desde la cola hasta el cuello con pinzas de relojero.
3. Retire suavemente los tejidos subcutáneos que permanecen adheridos a la piel pelada y alise los bordes de la piel con las tijeras de resorte afiladas.
4. Agregue 2 mL/pocillo del medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% y solución de penicilina/estreptomicina (diluida 1:100) a un pocillo en un plato de 6 pocillos. Una vez que se hayan agregado el medio y los antibióticos, coloque un inserto de cultivo de tejido estéril dentro del pocillo, de modo que el medio quede en el exterior del inserto de cultivo.
5. Transfiera la piel con una espátula al inserto de cultivo con la epidermis hacia arriba y el mesénquima hacia abajo en la membrana del inserto. Para asegurarse de que la piel quede plana sin arrugas, tire de la piel sobre la espátula en HBSS. Deslice la piel de la espátula con el líquido para facilitar la transferencia de la piel sin pliegues.
6. Elimine el exceso de HBSS del inserto de cultivo con una pipeta de 200 μL. Deje una capa delgada de HBSS dentro del inserto de cultivo para mantener el explante semihúmedo para proporcionar una interfaz aire-líquido.
7. Incubar los cultivos de explantes cutáneos a 37 °C utilizando 5% de CO₂ y 95% de aire. Cambie el medio cada 2 días.
   NOTA: Este procedimiento ha sido publicado⁴. Este sistema de cultivo también se puede utilizar con la piel de otras aves como cultivos de explantes de piel de codorniz o pinzón.

2. Recombinación epitelio-mesenquimal de la piel de pollo (Figura 2)

1. Incubar los huevos de gallina fertilizados en una incubadora humidificada a 38 °C y organizar los embriones de acuerdo con Hamburger y Hamilton¹⁴ (sección 1.1).
2. Prepare 2 soluciones salinas sin calcio y magnesio (CMF) con tampón de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25%.
   1. Prepare 10 tampones CMF (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH₂PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH₂PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO₃ (0,12 M) 10 g, glucosa (0,1 M) 20 g en 1.000 mL de agua destilada. Ajuste el pH a 7.3. Para hacer 100 mL de 2x CMF con tampón EDTA al 0,25%, el EDTA debe disolverse primero en 80 mL de agua destilada, luego agregar 20 mL de tampón CMF 10x para hacer 2x CMF con una solución de trabajo de EDTA al 0,25%.
3. Diseccionar las pieles dorsales de los embriones de pollo en la etapa 30-32 en HBSS como se ha descrito anteriormente (sección 1.2) e incubarlas en solución salina 2x CMF con EDTA al 0,25% en hielo durante 15-20 min.
4. Separe cuidadosamente el epitelio y el mesénquima con pinzas de relojero. Transfiera el epitelio y el mesénquima separados a un plato limpio que contenga HBSS.
5. Vuelva a combinar el epitelio con el mesénquima colocando primero el mesénquima en una placa de Petri que contenga HBSS, luego coloque el epitelio encima del mesénquima. Coloque el epitelio a lo largo del mismo eje antero-posterior que el mesénquima o gire el epitelio a^90º del eje antero-posterior del mesénquima para determinar qué componente regula diferentes aspectos de la morfogénesis de la piel.
6. Transfiera las pieles recombinadas a insertos de cultivo en placas de cultivo de 6 pocillos para su crecimiento y elimine el exceso de HBSS alrededor de la piel recombinada.
7. Coloque 2 mL de medio de cultivo DMEM con 10% de FBS en el pocillo fuera del inserto. Coloque una capa delgada de DMEM dentro de la cámara del inserto para mantener el explante semihúmedo para proporcionar una interfaz aire-líquido.
8. Incubar los recombinantes cutáneos a 37 °C en una mezcla de 5% de CO₂ y 95% de aire. Cambie el medio cada 2 días. Documente los cambios fenotípicos en las fases iniciales del desarrollo de la piel utilizando fotografía de lapso de tiempo con una cámara montada en un microscopio de disección.
   NOTA: Este procedimiento ha sido publicado¹¹.

3. Reconstitución de la piel de pollo (Figura 3)

1. Incubar los huevos de gallina fertilizados en una incubadora humidificada a 38 °C y organizar los embriones de acuerdo con Hamburger y Hamilton¹⁴ (sección 1.1).
2. Diseccionar las pieles dorsales de los embriones de pollo en estadio 30-33 en HBSS. Incubar las pieles en solución salina CMF 2x con 0,25% de EDTA en hielo durante 15-20 min como se ha descrito anteriormente (sección 2.3).
3. Separe cuidadosamente el epitelio y el mesénquima con pinzas de relojero. Transfiera el epitelio y el mesénquima separados a HBSS en hielo.
   NOTA: Tenga cuidado de no dañar la capa basal del epitelio al separar el epitelio del mesénquima.
4. Recoja el mesénquima separado en un tubo de centrífuga de 15 ml e incube con una solución de colagenasa/tripsina al 0,1% hecha en PBS en un baño de agua a 37 °C durante 10-15 minutos.
5. Disocie el mesénquima de la piel con una pipeta Pasteur para hacer una suspensión unicelular. Agregue DMEM con 10% de FBS para detener la digestión.
6. Pellet y centrifugar las células a 233 × g durante 5 min. Resuspendió las células con medio de cultivo a una concentración de 2 × 10⁷ células/mL.
   NOTA: En este paso, las células mesenquimales también se pueden resuspender en un medio que contiene virus durante 2-3 horas en hielo para la transducción de genes.
7. Coloque un inserto de cultivo celular en un pocillo de un plato de 6 pocillos. Deje caer 10 μL de 2 × 10⁷ células/mL de células mesenquimales en el inserto de cultivo de tejidos. Coloque 2 ml de medio de cultivo DMEM con 10% de FBS en el pocillo exterior del inserto. Incubar las células mesenquimales en placa a 37 °C utilizando una incubadora de 5% de CO₂ y 95% de aire durante 1 h para permitir que las células se asienten en la membrana del inserto.
8. Transfiera el epitelio intacto sobre la gota mesenquimal plateada con la capa de células basales del epitelio frente a las células mesenquimales utilizando una pipeta de 1 mL.
   NOTA: Al transferir el epitelio a la gota mesenquimatosa, las células mesenquimales no deben ser alteradas.
9. Aplana el epitelio intacto sobre el mesénquima para hacer el explante de la piel reconstituida. Deje una capa delgada del medio en el inserto para mantener el explante de piel reconstituido semihúmedo para proporcionar una interfaz aire-líquido. Incubar el explante de piel reconstituida a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂ y 95% de aire. Cambie el medio cada 2 días.
   NOTA: Este procedimiento ha sido publicado¹³.

Resultados

Cultivos de explantes cutáneos
El desarrollo de las yemas de las plumas a partir de cultivos de órganos cutáneos ex vivo puede observarse directamente bajo el microscopio. Utilizando el modelo de cultivo de explante de piel dorsal de pollo en estadio 30, las placodas son visibles a lo largo de la línea media. Luego, el frente morfogenético se propaga gradualmente lateralmente hacia la periferia de la piel con la formación de nuevos primordios plumosos. Estos primordios de plumas se desa...

Discusión

La recombinación de tejidos proporciona un ensayo para explorar las contribuciones únicas del epitelio y el mesénquima. En los pollos, las plumas comienzan a desarrollarse en el día embrionario 7 (E7), mientras que las escamas comienzan en E9. Cuando el mesénquima de escamas E9 se recombina con el epitelio de las plumas E7, el tejido recombinado forma escamas, y cuando el mesénquima de las plumas E7 se recombina con el epitelio de las escamas E9, se forman plumas¹¹. Estos estudios han demost...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042