Uso de explantes de piel de ave para estudiar el patrón de tejidos y la organogénesis

Resumen

Aquí describimos los protocolos para tres tipos de cultivos de explantes de piel embrionaria aviar que se pueden utilizar para examinar las interacciones de los tejidos, la película de lapso de tiempo de imágenes 4D (3D más tiempo), la perturbación global o local de la función molecular y la caracterización de la biología de sistemas.

Resumen

El desarrollo de la piel aviar durante la embriogénesis es un modelo único que puede proporcionar información valiosa sobre el patrón de los tejidos. Aquí se describen tres variaciones de los cultivos de explantes cutáneos para examinar diferentes aspectos del desarrollo de la piel. En primer lugar, los cultivos y manipulaciones de órganos ex vivo ofrecen a los investigadores la oportunidad de observar y estudiar directamente el desarrollo de las yemas de las plumas. El cultivo de explantes de piel puede crecer durante 7 días, lo que permite el análisis directo del comportamiento celular y la obtención de imágenes 4D a intervalos durante este período de crecimiento. Esto también permite manipulaciones físicas y moleculares de las condiciones de cultivo para visualizar la respuesta de los tejidos. Por ejemplo, las cuentas recubiertas con factor de crecimiento se pueden aplicar localmente para inducir cambios en el patrón de las plumas en un área limitada. Alternativamente, la transducción viral puede administrarse globalmente en los medios de cultivo para aumentar o disminuir la expresión génica. En segundo lugar, el protocolo de recombinación de piel permite a los investigadores investigar las interacciones de los tejidos entre la epidermis y el mesénquima que se derivan de diferentes regiones de la piel, diferentes etapas de la vida o diferentes especies. Esto brinda la oportunidad de probar la ventana de tiempo en la que el epitelio es competente para responder a las señales y su capacidad para formar diferentes apéndices de la piel en respuesta a señales de diferentes fuentes mesenquimales. En tercer lugar, la reconstitución de la piel mediante el uso de células dérmicas disociadas superpuestas con epitelio intacto restablece el desarrollo de la piel y permite el estudio de los procesos iniciales de patrones periódicos. Este enfoque también mejora nuestra capacidad para manipular la expresión génica entre las células disociadas antes de crear el explante de piel reconstituido. Este artículo proporciona los tres protocolos de cultivo y experimentos ejemplares para demostrar su utilidad.

Introducción

El desarrollo de la piel del embrión aviar es un excelente modelo para estudiar los mecanismos de morfogénesis debido a los distintos patrones y la accesibilidad a la microcirugía y la manipulación ^1,2. Sin embargo, la evaluación de eventos celulares y moleculares en tejidos intactos puede ser difícil porque la presencia de tejidos extraños puede complicar las observaciones microscópicas. Además, la capacidad de manipular la expresión génica para probar su papel en la morfogénesis de la piel no siempre es una tarea sencilla. Descubrimos que podemos probar las funciones de los genes mediante la transducción ret....

Protocolo

1. Cultivo de explantes de piel de pollo (Figura 1)

1. Incubar los huevos de gallina fertilizados en una incubadora humidificada a 38 °C y escalonarlos de acuerdo con Hamburger y Hamilton¹⁴.
   1. En la etapa 28 (~E5.5), el segundo dedo y el tercer dedo de la extremidad son más largos que los demás; Tres dedos y cuatro dedos son distintos.
   2. En la etapa 29 (~E6), el ala se dobla a la altura del codo; El segundo dígito es claramente más largo que los demás.
   3. En la etapa 30 (~E6.5), dos filas de yemas de plumas dorsales a cada lado de la mé....

Discusión

La recombinación de tejidos proporciona un ensayo para explorar las contribuciones únicas del epitelio y el mesénquima. En los pollos, las plumas comienzan a desarrollarse en el día embrionario 7 (E7), mientras que las escamas comienzan en E9. Cuando el mesénquima de escamas E9 se recombina con el epitelio de las plumas E7, el tejido recombinado forma escamas, y cuando el mesénquima de las plumas E7 se recombina con el epitelio de las escamas E9, se forman plumas¹¹. Estos estudios han demost.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042