조직 패터닝 및 유기 형성을 연구하기 위해 조류 피부 이식물을 사용합니다.

요약

여기에서는 조직 상호 작용, 4D 이미징 타임랩스 동영상(3D 플러스 타임), 분자 기능의 전역 또는 국소 섭동 및 시스템 생물학 특성화를 검사하는 데 사용할 수 있는 세 가지 유형의 조류 배아 피부 이식 배양에 대한 프로토콜을 설명합니다.

초록

배아 발생 중 발달하는 조류 피부는 조직 패터닝에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 독특한 모델입니다. 여기에서는 피부 발달의 다양한 측면을 조사하기 위해 피부 이식 배양에 대한 세 가지 변형에 대해 설명합니다. 첫째, 체외 장기 배양 및 조작은 연구자들에게 깃털 싹의 발달을 직접 관찰하고 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 피부 이식 배양은 7일 동안 성장할 수 있으므로 이 성장 기간 동안 세포 거동을 직접 분석하고 4D 이미징을 할 수 있습니다. 또한 배양 조건의 물리적 및 분자적 조작을 통해 조직 반응을 시각화할 수 있습니다. 예를 들어, 성장 인자 코팅 비드를 국소적으로 적용하여 제한된 영역에서 깃털 패턴의 변화를 유도할 수 있습니다. 대안적으로, 바이러스 transduction은 유전자 발현을 상향 또는 하향 조절하기 위해 배양 배지에서 전 세계적으로 전달될 수 있습니다. 둘째, 피부 재조합 프로토콜을 통해 연구자들은 서로 다른 피부 영역, 다른 생애 단계 또는 다른 종에서 파생된 표피와 중간엽 사이의 조직 상호 작용을 조사할 수 있습니다. 이는 상피가 신호에 반응할 수 있는 시간 창과 다양한 중간엽 소스의 신호에 반응하여 다른 피부 부속기를 형성하는 능력을 테스트할 수 있는 기회를 제공합니다. 셋째, 온전한 상피와 겹쳐진 해리된 진피 세포를 사용한 피부 재구성은 피부 발달을 재설정하고 주기적인 패턴의 초기 과정을 연구할 수 있도록 합니다. 이 접근법은 또한 재구성된 피부 이식을 생성하기 전에 해리된 세포 간의 유전자 발현을 조작하는 능력을 향상시킵니다. 이 논문은 세 가지 배양 프로토콜과 그 유용성을 입증하기 위한 모범적인 실험을 제공합니다.

서문

조류 배아 피부 발달은 뚜렷한 패턴과 미세수술 및 조작에 대한 접근성 때문에 형태형성의 메커니즘을 연구하기 위한 훌륭한 모델이다 ^1,2. 그러나 손상되지 않은 조직에서 세포 및 분자 이벤트를 평가하는 것은 외부 조직의 존재가 현미경 관찰을 복잡하게 만들 수 있기 때문에 어려울 수 있습니다. 또한, 피부 형태 형성에서 자신의 역할을 테스트하기 위해 유전자 발현을 조작하는 능력은 항상 간단한 작업이 아닙니다. 우리는 피부 이식 모델을 사용하여 더 높은 성공률로 레트로바이러스 형질도입을 사용하여 유전자 기능을 테스트할 수 있음을 발견했습니다. 여기에서는 개발된 세 가지 피부 이식 모델의 장점에 대해 논의합니다.

조류 배아 피부 배양은 피부 깃털 새싹 발달 중 세포 행동, 유전자 조절 및 기능을 평가하는 강력한 시스템입니다 3,4,5,6. 이를 통해 배양 배지에 배치된 성장 인자의 전반적인 추가 또는 성장 인자 코팅 비드에서 국부적으로 방출되는 성장 인자를 통해 깃털 새싹 발달의 분자 메커니즘을 평가할 수 있습니다. 발달 조절 유전자는 특정 형태 유전학적 사건에서 자신의 역할을 평가하는 기능 연구를 위해 온전하거나 우성적인 음성 형태의 바이러스 유전자 전달을 사용하여 조작할 수도 있습니다 ^7,8.

조류 상피-중간엽 재조합 배양을 통해 조사관은 피부 형태 형성의 초기 단계에서 각 피부 구성 요소의 기여도를 결정할 수 있습니다. 롤즈(Rawles)는 이 접근법을 사용하여 중간엽(mesenchyme)과 상피(epithelium) 사이의 상호작용이 피부 부속지를 형성하는 데 필수적이라는 것을 밝혀냈다⁹. 중간엽은 응축을 형성할 수 있으며 상피는 중간엽 응축 형성을 유도하고 유지하는 데 필요합니다². 나중에, 이 접근법은 비늘이 없는 닭이 깃털을 형성하지 못하는 이유를 평가하는 데 사용되었습니다. 결함은 중간엽¹⁰에 있는 것으로 밝혀졌습니다. Dhouailly는 다른 종의 배아에서 조직 상피-중간엽 재조합 연구를 수행했습니다. 이러한 연구는 피부 형태 형성을 촉진하는 상피-중간엽 통신에 대한 발달 및 진화론적 통찰력을 제공했다³.

이 연구는 깃털 성장을 제어하는 요인을 더 잘 이해하기 위해 사용되었습니다. 이 방법은 또한 전방-후방 축을 따라 깃털 시작, 발달 및 신장 중에 발생하는 피부 패턴화와 관련된 세포 및 분자 이벤트의 시각화를 향상시킵니다. 상피가 중간엽에서 분리되고 두 구성 요소가 재결합되면 새로운 상호 작용이 피부 패턴을 다시 확립합니다. 이 접근법은 표피가 중간엽 신호에 반응할 수 있도록 하는 중간엽 유도 신호와 상피 역량 분자를 평가할 수 있게 해준다¹¹. 깃털 새싹 발달 및 패턴 형성에 필요한 후속 다운스트림 분자 발현도 검사할 수 있습니다. 이 연구는 새싹의 위치가 중간엽에 의해 제어된다는 것을 입증했습니다. 중간엽과 재결합하기 전에 상피 90^o 의 회전은 깃털 새싹 신장의 방향이 상피에 의해 제어됨을 보여줍니다. 이 방법은 깃털 새싹 방향을 조절하는 분자 메커니즘을 연구하는 데 필수적이었습니다¹².

조류 피부 재구성 배양은 피부 중간엽을 단일 세포로 해리한 후 높은 세포 밀도로 도금하고 온전한 상피를 덮어 진피 세포를 원시 상태로 재설정합니다. 그런 다음 explant는 이전 신호⁽¹³)와 독립적 인 새로운 주기적 패턴을 형성하기 위해 자기 조직화합니다. 이 피부 재구성 모델은 깃털 주기적 패터닝의 초기 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이 접근 방식을 사용하여 단일 상피 조각에 대한 중간엽 세포의 비율을 조절하는 것이 깃털 새싹의 크기나 수에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 조사했습니다. 새싹의 수는 증가했지만 중간엽 세포의 비율이 증가함에 따라 새싹의 크기는 증가하지 않는 것으로 나타났습니다. 이 접근법의 또 다른 장점은 중간엽 세포 바이러스 형질도입이 다른 두 가지 배양 조건보다 더 높은 효율성을 보이고 더 명확한 표현형을 생성할 수 있다는 것입니다.

프로토콜

1. 닭 피부 이식 배양 (그림 1)

1. 38°C의 가습 인큐베이터에서 수정된 닭고기 난자를 배양하고 Hamburger and Hamilton¹⁴에 따라 단계를 결정합니다.
   1. 28단계(~E5.5)에서 사지의 두 번째 손가락과 세 번째 발가락은 다른 발가락보다 길다. 세 개의 숫자와 네 개의 발가락이 뚜렷합니다.
   2. 스테이지 29 (~ E6)에서 날개는 팔꿈치에서 구부러집니다. 두 번째 숫자는 다른 숫자보다 뚜렷하게 깁니다.
   3. 30기(~E6.5)에서, 척수 양쪽으로 두 줄의 등쪽 깃털 싹 줄이 상완 수준에서 보이고 세 줄의 깃털 봉오리가 다리 수준에서 보입니다.
   4. 31 단계 (~ E7)에는 점보 천골 수준에 ~ 7 줄의 깃털이 있습니다.
   5. 32 단계에서는 11 줄 이상의 깃털 싹이 다리 높이에 존재합니다.
2. 28-32단계 닭 배아를 Hanks의 완충 식염수(HBSS) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 60mm 페트리 접시에 넣습니다.
   1. 목 아래쪽에서 꼬리 부분까지 배아 등쪽 피부를 절개합니다. 가위를 사용하여 목에서 머리를 제거하십시오. 팔다리 새싹을 부드럽게 당겨 부속지가 바깥쪽으로 퍼지도록 몸의 복부 쪽을 아래쪽으로 배치합니다.
   2. 워치메이커의 집게나 날카로운 스프링 가위를 사용하여 배아체의 양쪽 측면을 따라 피부의 전방에서 후방 절개를 만듭니다. 한 쌍의 집게로 팔다리 싹을 세로로 꼬집어 몸을 안정시켜야 합니다. 워치메이커의 집게를 사용하여 목에서 꼬리 부분 또는 꼬리에서 목까지 피부를 부드럽게 벗겨냅니다.
3. 벗겨진 피부에 붙어있는 피하 조직을 부드럽게 제거하고 날카로운 스프링 가위로 피부의 가장자리를 매끄럽게 합니다.
4. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 페니실린/스트렙토마이신 용액(1:100으로 희석)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 2mL/웰을 6웰 접시에 담아 웰에 넣습니다. 배지와 항생제를 추가한 후에는 멸균 조직 배양 삽입물을 웰 내부에 넣어 배지가 배양 삽입물의 외부에 오도록 합니다.
5. 주걱으로 피부를 표피가 위로 향하게 하고 중간엽이 아래를 향하게 하여 삽입 멤브레인에 전달합니다. 피부가 주름 없이 평평하게 놓이도록 하려면 피부를 HBSS의 주걱으로 당깁니다. 액체로 주걱에서 피부를 밀어내어 접히지 않고 피부를 쉽게 옮길 수 있습니다.
6. 200 μL 피펫으로 배양 삽입물에서 과도한 HBSS를 제거합니다. 배양 삽입물 내부에 HBSS의 얇은 층을 두어 explant를 반습윤 상태로 유지하여 공기-액체 인터페이스를 제공합니다.
7. 5 % CO₂ 및 95 % 공기를 사용하여 37 ° C에서 피부 이식 배양액을 배양합니다. 2일마다 매체를 교체하십시오.
   참고: 이 절차^{는 4에} 게시되었습니다. 이 배양 시스템은 메추라기 또는 핀치 피부 이식 배양과 같은 다른 새의 피부에도 사용할 수 있습니다.

2. 닭 피부 상피-중간엽 재조합(그림 2)

1. 38°C의 가습 인큐베이터에서 수정된 닭고기 난자를 배양하고 Hamburger and Hamilton¹⁴ (섹션 1.1)에 따라 배아를 병기결정합니다.
2. 0.25% 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 완충액과 함께 2x 무칼슘(CMF) 식염수를 준비합니다.
   1. 증류수 1,000mL에 10x CMF 완충액(NaCl(1.37M) 80g, KCl(0.04M) 3g,_NaH2PO4(0.004M) 0.5g,_KH2PO4(2M) 0.25g, NaHCO3(0.12M) 10g, 포도당(0.1M) 20g을 증류수 1,000mL에 넣는다. pH를 7.3으로 조정합니다. 0.25% EDTA 완충액으로 100mL의 2x CMF를 만들려면 먼저 EDTA를 증류수 80mL에 용해시킨 다음 20mL의 10x CMF 완충액을 첨가하여 0.25% EDTA 작동 용액으로 2x CMF를 만들어야 합니다.
3. 위에서 설명한 대로 HBSS에서 30-32단계의 닭 배아 등쪽 피부를 절개하고(섹션 1.2) 얼음에 0.25% EDTA가 있는 2x CMF 식염수에 15-20분 동안 배양합니다.
4. 워치메이커의 집게를 사용하여 상피와 중간엽을 조심스럽게 분리합니다. 분리된 상피와 중간엽을 HBSS가 함유된 깨끗한 접시에 옮깁니다.
5. 먼저 HBSS가 포함된 페트리 접시에 중간엽을 놓아 상피와 중간엽을 재결합한 다음 중간엽 위에 상피를 놓습니다. 중간엽과 동일한 전방-후방 축을 따라 상피를 배치하거나 중간엽의 전방-후방 축에서 상피를 90^o 돌려 피부 형태 형성의 다양한 측면을 조절하는 구성 요소를 결정합니다.
6. 재조합된 스킨을 성장을 위해 6-well 배양 접시의 배양 삽입물로 옮기고 재결합된 스킨 주변의 과도한 HBSS를 제거합니다.
7. 10% FBS가 포함된 DMEM 배양 배지 2mL를 인서트 외부의 웰에 넣습니다. 인서트 챔버 내부에 DMEM의 얇은 층을 배치하여 엑스플랜트를 반습식 상태로 유지하여 공기-액체 인터페이스를 제공합니다.
8. 37 ° C에서 5 % CO₂ 및 95 % 공기의 혼합물로 피부 재조합 물질을 배양합니다. 2일마다 매체를 교체하십시오. 해부 현미경에 장착된 카메라로 타임랩스 사진을 사용하여 피부 발달의 초기 피부 단계에서 표현형 변화를 문서화합니다.
   참고: 이 절차는¹¹에 게시되었습니다.

3. 닭 피부 재구성(그림 3)

1. 38°C의 가습 인큐베이터에서 수정된 닭고기 난자를 배양하고 Hamburger and Hamilton¹⁴ (섹션 1.1)에 따라 배아를 병기결정합니다.
2. HBSS에서 30-33기 닭 배아 등쪽 피부를 절개합니다. 위에서 설명한 대로 0.25% EDTA가 있는 2x CMF 식염수에 스킨을 얼음에 15-20분 동안 배양합니다(섹션 2.3).
3. 워치메이커의 집게를 사용하여 상피와 중간엽을 조심스럽게 분리합니다. 분리된 상피와 중간엽을 얼음 위의 HBSS로 옮깁니다.
   알림: 중간엽에서 상피를 분리할 때 상피의 기저층이 손상되지 않도록 주의하십시오.
4. 분리된 중간엽을 15mL 원심분리 튜브에 모으고 PBS에서 만든 0.1% 콜라겐분해효소/트립신 용액으로 37°C 수조에서 10-15분 동안 배양합니다.
5. 파스퇴르 피펫으로 피부 중간엽을 해리하여 단세포 현탁액을 만듭니다. 소화를 멈추기 위해 10% FBS가 함유된 DMEM을 첨가하십시오.
6. 233 × g 에서 5분 동안 세포를 펠릿하고 원심분리합니다. 2 × 10⁷ cells/mL의 농도로 배양 배지로 세포를 재현탁시켰다.
   참고: 이 단계에서 중간엽 세포는 유전자 전달을 위해 얼음 위에서 2-3시간 동안 바이러스 함유 배지에 재현탁될 수도 있습니다.
7. 세포 배양 삽입물을 6웰 접시의 한 웰에 넣습니다. 조직 배양 삽입물에 2 × 10⁷ cells/mL 중간엽 세포 10 μL를 드롭합니다. 10% FBS가 있는 DMEM 배양 배지 2ml를 인서트 외부의 웰에 넣습니다. 5% CO₂ 및 95% 공기 인큐베이터를 사용하여 37°C에서 1시간 동안 도금된 중간엽 세포를 배양하여 세포가 삽입막에 정착할 수 있도록 합니다.
8. 1mL 피펫을 사용하여 상피 기저 세포층이 중간엽 세포를 향하도록 도금된 중간엽 방울 위에 온전한 상피를 옮깁니다.
   참고: 상피를 중간엽 방울로 옮길 때 중간엽 세포가 방해받지 않아야 합니다.
9. 중간엽 위에 온전한 상피를 평평하게 하여 재구성된 피부가 이식되도록 합니다. 인서트에 매체의 얇은 층을 남겨 재구성된 피부 외출물을 반습윤 상태로 유지하여 공기-액체 인터페이스를 제공합니다. 재구성 된 피부 이식물을 37 ° C에서 5 % CO₂ 및 95 % 공기 인큐베이터에서 배양합니다. 2일마다 매체를 교체하십시오.
   참고: 이 절차는¹³에 게시되었습니다.

결과

피부 이식 배양
체외 피부 장기 배양에서 얻은 깃털 새싹 발달은 현미경으로 직접 관찰할 수 있습니다. 닭 30기 등쪽 피부의 피부 이식 배양 모델을 사용하여 정중선을 따라 플라코드를 볼 수 있습니다. 그런 다음 형태 유전 학적 전선은 새로운 깃털 원시적 (feather primordia)의 형성과 함께 피부 주변부를 향해 점차적으로 측면으로 전파됩니다. 이 깃털 원시골은 배양 후 2일 후에...

토론

조직 재조합은 상피와 중간엽의 고유한 기여를 탐구하기 위한 분석을 제공합니다. 닭의 경우 깃털은 배아 7일(E7)에 발달하기 시작하고 비늘은 E9에서 시작됩니다. E9 비늘 중간엽이 E7 깃털 상피와 재결합되면 재결합된 조직이 비늘을 형성하고, E7 깃털 중간엽이 E9 비늘 상피와 재결합하면 깃털이 형성된다¹¹. 이러한 연구는 중간엽(mesenchyme)이 패턴 형성, 간격 및 장기 정체성을 제?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042