Utilizzo di espianti di pelle aviaria per studiare il patterning e l'organogenesi dei tessuti

Riepilogo

Qui descriviamo i protocolli per tre tipi di colture di espianti di pelle embrionale aviaria che possono essere utilizzate per esaminare le interazioni tissutali, il filmato timelapse di imaging 4D (3D più tempo), la perturbazione globale o locale della funzione molecolare e la caratterizzazione della biologia dei sistemi.

Abstract

Lo sviluppo della pelle aviaria durante l'embriogenesi è un modello unico in grado di fornire preziose informazioni sulla modellazione dei tessuti. Qui vengono descritte tre variazioni sulle colture di espianti cutanei per esaminare diversi aspetti dello sviluppo cutaneo. In primo luogo, le colture e le manipolazioni di organi ex vivo offrono ai ricercatori l'opportunità di osservare e studiare direttamente lo sviluppo dei boccioli di piume. La coltura di espianti cutanei può crescere per 7 giorni, consentendo l'analisi diretta del comportamento cellulare e l'imaging 4D a intervalli durante questo periodo di crescita. Ciò consente anche manipolazioni fisiche e molecolari delle condizioni di coltura per visualizzare la risposta dei tessuti. Ad esempio, le perle rivestite con fattore di crescita possono essere applicate localmente per indurre cambiamenti nel disegno delle piume in un'area limitata. In alternativa, la trasduzione virale può essere somministrata a livello globale nei terreni di coltura per aumentare o diminuire l'espressione genica. In secondo luogo, il protocollo di ricombinazione cutanea consente ai ricercatori di studiare le interazioni tissutali tra l'epidermide e il mesenchima che derivano da diverse regioni della pelle, diverse fasi di vita o diverse specie. Ciò offre l'opportunità di testare la finestra temporale in cui l'epitelio è competente a rispondere ai segnali e la sua capacità di formare diverse appendici cutanee in risposta a segnali provenienti da diverse fonti mesenchimali. In terzo luogo, la ricostituzione della pelle utilizzando cellule dermiche dissociate sovrapposte a epitelio intatto ripristina lo sviluppo della pelle e consente lo studio dei processi iniziali di patterning periodico. Questo approccio migliora anche la nostra capacità di manipolare l'espressione genica tra le cellule dissociate prima di creare l'espiante cutaneo ricostituito. Questo documento fornisce i tre protocolli di coltura ed esperimenti esemplari per dimostrarne l'utilità.

Introduzione

Lo sviluppo della pelle degli embrioni aviari è un modello eccellente per studiare i meccanismi della morfogenesi a causa dei modelli distinti e dell'accessibilità alla microchirurgia e alla manipolazione ^1,2. Tuttavia, la valutazione degli eventi cellulari e molecolari nei tessuti intatti può essere difficile perché la presenza di tessuti estranei può complicare le osservazioni microscopiche. Inoltre, la capacità di manipolare l'espressione genica per testare il loro ruolo nella morfogenesi cutanea non è sempre un compito semplice. Scopriamo che possiamo testare le funzioni geniche utilizzando la trasduzione retrovirale con un tasso di successo più elevato utilizzando modelli di espianti cutanei. Qui discutiamo i vantaggi di tre modelli di espianti di pelle che sono stati sviluppati.

La coltura embrionale aviaria della pelle è un potente sistema per valutare il comportamento cellulare, la regolazione genica e la funzione durante lo sviluppo delle gemme delle piume della pelle ^3,4,5,6. Consente di valutare i meccanismi molecolari dello sviluppo delle gemme di piume attraverso l'aggiunta globale di fattori di crescita posti nei terreni di coltura o il loro rilascio locale da perle rivestite di fattore di crescita. I geni regolatori dello sviluppo possono anche essere manipolati utilizzando la trasduzione genica virale di forme negative intatte o dominanti per studi funzionali che valutano il loro ruolo in specifici eventi morfogenetici ^7,8.

La coltura di ricombinazione epiteliale-mesenchimale aviaria consente ai ricercatori di determinare i contributi di ciascun componente cutaneo durante le prime fasi della morfogenesi cutanea. L'uso di questo approccio da parte di Rawles ha rivelato che le interazioni tra il mesenchima e l'epitelio sono essenziali per la formazione delle appendici cutanee⁹. Il mesenchima può formare condensazioni e l'epitelio è necessario per indurre e mantenere le formazioni di condensazione mesenchimale². Successivamente, questo approccio è stato utilizzato per valutare il motivo per cui i polli senza squame non riescono a formare piume. Si è scoperto che il difetto era nel mesenchima¹⁰. Dhouailly ha eseguito studi di ricombinazione epiteliale-mesenchimale tissutale in embrioni di specie diverse. Questi studi hanno fornito informazioni sullo sviluppo e sull'evoluzione delle comunicazioni epitelio-mesenchimali che promuovono la morfogenesi cutanea³.

Questo studio è stato utilizzato per comprendere meglio i fattori che controllano la crescita delle piume. Il metodo migliora anche la visualizzazione degli eventi cellulari e molecolari coinvolti nel patterning cutaneo che si verificano durante l'inizio, lo sviluppo e l'allungamento delle piume lungo l'asse antero-posteriore. Quando l'epitelio viene separato dal mesenchima e i due componenti vengono quindi ricombinati, nuove interazioni ristabiliscono il pattern cutaneo. Questo approccio ci permette di valutare i segnali induttori mesenchimali e le molecole di competenza epiteliale che consentono all'epidermide di rispondere ai segnali mesenchimali¹¹. Può essere esaminata anche la successiva espressione molecolare a valle, necessaria per lo sviluppo delle gemme di piume e la formazione del modello. Questi studi hanno stabilito che la posizione delle gemme è controllata dal mesenchima. La rotazione dell'epitelio di 90^o prima della ricombinazione con il mesenchima dimostra che la direzione dell'allungamento della gemma della piuma è controllata dall'epitelio. Questo metodo è stato essenziale per noi per studiare il meccanismo molecolare che regola l'orientamento delle gemme delle piume¹².

La coltura di ricostituzione della pelle aviaria, in cui il mesenchima cutaneo viene dissociato da singole cellule prima di essere placcato ad alta densità cellulare e ricoperto da epitelio intatto, ripristina le cellule dermiche a uno stato primordiale. L'espianto quindi si auto-organizza per formare un nuovo modello periodico indipendente dai segnali precedenti¹³. Questo modello di ricostituzione della pelle può essere utilizzato per studiare i processi iniziali del pattern periodico delle piume. Abbiamo utilizzato questo approccio per esplorare come la modulazione del rapporto tra cellule mesenchimali e un singolo pezzo di epitelio possa influenzare la dimensione o il numero di gemme di piume. È stato riscontrato che il numero di gemme aumenta, ma non le dimensioni delle gemme all'aumentare del rapporto tra le cellule mesenchimali. Un altro vantaggio di questo approccio è che la trasduzione virale delle cellule mesenchimali mostra un'efficienza maggiore rispetto alle altre due condizioni di coltura e può produrre fenotipi più evidenti.

Protocollo

1. Coltura di espiantazione di pelle di pollo (Figura 1)

1. Incubare le uova di gallina fecondate in un'incubatrice umidificata a 38 °C e metterle in scena secondo Hamburger e Hamilton¹⁴.
   1. Allo stadio 28 (~E5.5), il secondo dito e il terzo dito dell'arto sono più lunghi degli altri; Tre dita e quattro dita dei piedi sono distinte.
   2. Al punto 29 (~E6), l'ala è piegata all'altezza del gomito; La seconda cifra è nettamente più lunga delle altre.
   3. Allo stadio 30 (~E6.5), due file di gemme di piume dorsali su entrambi i lati del midollo spinale sono visibili a livello brachiale e tre file sono visibili a livello delle zampe.
   4. Allo stadio 31 (~E7), ci sono ~7 file di piume ai livelli jumbo-sacrali.
   5. Allo stadio 32, sono presenti undici o più file di gemme di piume a livello delle zampe.
2. Mettere un embrione di pollo allo stadio 28-32 in una piastra di Petri da 60 mm contenente la soluzione salina tamponata di Hanks (HBSS) o la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   1. Sezionare la pelle dorsale dell'embrione tra la parte inferiore del collo e la regione della coda. Usa le forbici per rimuovere la testa dal collo. Tirare delicatamente le gemme degli arti per posizionare il lato ventrale del corpo verso il basso con le appendici che si allargano verso l'esterno.
   2. Praticare un'incisione anteriore o posteriore nella pelle lungo i due lati laterali del corpo dell'embrione utilizzando una pinza da orologiaio o forbici a molla affilate. Assicurati di stabilizzare il corpo con un paio di pinze pizzicando longitudinalmente le gemme degli arti. Sbucciare delicatamente la pelle dal collo alla regione della coda o dalla coda al collo usando una pinza da orologiaio.
3. Rimuovere delicatamente i tessuti sottocutanei che rimangono attaccati alla pelle sbucciata e levigare i bordi della pelle con le forbici a molla affilate.
4. Aggiungere 2 mL/pozzetto di terreno di Eagle's modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e soluzione di penicillina/streptomicina (diluita 1:100) in un pozzetto in un piatto a 6 pozzetti. Una volta aggiunti il terreno e gli antibiotici, posizionare un inserto di coltura tissutale sterile all'interno del pozzetto, in modo che il terreno si trovi all'esterno dell'inserto di coltura.
5. Trasferire la pelle con una spatola sull'inserto di coltura con l'epidermide rivolta verso l'alto e il mesenchima rivolto verso il basso sulla membrana dell'inserto. Per garantire che la pelle sia piatta senza pieghe, tirare la pelle sulla spatola in HBSS. Far scivolare la pelle dalla spatola con il liquido per facilitare il trasferimento della pelle senza piegarla.
6. Rimuovere l'eccesso di HBSS dall'inserto di coltura con una pipetta da 200 μl. Lasciare uno strato sottile di HBSS all'interno dell'inserto di coltura per mantenere l'espiante semi-umido e fornire un'interfaccia aria-liquido.
7. Incubare le colture di espianti cutanei a 37 °C utilizzando il 5% di CO₂ e il 95% di aria. Cambia il mezzo ogni 2 giorni.
   NOTA: Questa procedura è stata pubblicata⁴. Questo sistema di coltura può essere utilizzato anche con la pelle di altri uccelli come le colture di espianti di quaglie o fringuelli.

2. Ricombinazione epiteliale-mesenchimale della pelle di pollo (Figura 2)

1. Incubare le uova di gallina fecondate in un'incubatrice umidificata a 38 °C e mettere in scena gli embrioni secondo Hamburger e Hamilton¹⁴ (sezione 1.1).
2. Preparare 2 soluzioni saline prive di calcio e magnesio (CMF) con tampone di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) allo 0,25%.
   1. Preparare 10 tamponi CMF (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH₂PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH₂PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO₃ (0,12 M) 10 g, glucosio (0,1 M) 20 g in 1.000 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7,3. Per ottenere 100 mL di 2x CMF con tampone EDTA allo 0,25%, l'EDTA deve essere prima sciolto in 80 mL di acqua distillata, quindi aggiungere 20 mL di tampone CMF 10x per ottenere 2x CMF con soluzione di lavoro EDTA allo 0,25%.
3. Sezionare le pelli dorsali di embrioni di pollo allo stadio 30-32 in HBSS come descritto sopra (sezione 1.2) e incubarle in soluzione salina 2x CMF con EDTA allo 0,25% su ghiaccio per 15-20 minuti.
4. Separare accuratamente l'epitelio e il mesenchima utilizzando una pinza da orologiaio. Trasferire l'epitelio e il mesenchima separati in un piatto pulito contenente HBSS.
5. Ricombinare l'epitelio con il mesenchima posizionando prima il mesenchima su una piastra di Petri contenente HBSS, quindi posizionare l'epitelio sopra il mesenchima. Posizionare l'epitelio lungo lo stesso asse antero-posteriore del mesenchima o ruotare l'epitelio di 90^o rispetto all'asse antero-posteriore del mesenchima per determinare quale componente regola i diversi aspetti della morfogenesi cutanea.
6. Trasferire le pelli ricombinate negli inserti di coltura in piastre di coltura a 6 pozzetti per la crescita e rimuovere l'eccesso di HBSS attorno alla pelle ricombinata.
7. Inserire 2 mL di terreno di coltura DMEM con il 10% di FBS nel pozzetto all'esterno dell'inserto. Posizionare un sottile strato di DMEM all'interno della camera di inserimento per mantenere l'espiante semi-umido e fornire un'interfaccia aria-liquido.
8. Incubare i ricombinanti cutanei a 37 °C in una miscela di 5% CO₂ e 95% di aria. Cambia il mezzo ogni 2 giorni. Documenta i cambiamenti fenotipici nelle fasi iniziali dello sviluppo cutaneo utilizzando la fotografia time-lapse con una fotocamera montata su un microscopio da dissezione.
   NOTA: Questa procedura è stata pubblicata¹¹.

3. Ricostituzione della pelle di pollo (Figura 3)

1. Incubare le uova di gallina fecondate in un'incubatrice umidificata a 38 °C e mettere in scena gli embrioni secondo Hamburger e Hamilton¹⁴ (sezione 1.1).
2. Sezionare le pelli dorsali dell'embrione di pollo allo stadio 30-33 in HBSS. Incubare le pelli in 2x soluzione salina CMF con EDTA allo 0,25% su ghiaccio per 15-20 minuti come descritto sopra (paragrafo 2.3).
3. Separare accuratamente l'epitelio e il mesenchima utilizzando una pinza da orologiaio. Trasferire l'epitelio e il mesenchima separati in HBSS su ghiaccio.
   NOTA: Fare attenzione a non danneggiare lo strato basale dell'epitelio quando si separa l'epitelio dal mesenchima.
4. Raccogliere il mesenchima separato in una provetta da centrifuga da 15 mL e incubare con una soluzione di collagenasi/tripsina allo 0,1% prodotta in PBS in un bagno d'acqua a 37 °C per 10-15 minuti.
5. Dissociare il mesenchima cutaneo con una pipetta Pasteur per ottenere una sospensione unicellulare. Aggiungi DMEM con il 10% di FBS per fermare la digestione.
6. Pellettare e centrifugare le celle a 233 × g per 5 min. Risospendere le cellule con il terreno di coltura a una concentrazione di 2 × 10⁷ cellule/mL.
   NOTA: A questo punto, le cellule mesenchimali possono anche essere risospese in un terreno contenente virus per 2-3 ore su ghiaccio per la trasduzione genica.
7. Posizionare un inserto per colture cellulari in un pozzetto di un piatto a 6 pozzetti. Far cadere 10 μL di 2 × 10⁷ cellule/mL di cellule mesenchimali sull'inserto di coltura tissutale. Posizionare 2 ml di terreno di coltura DMEM con il 10% di FBS nel pozzetto all'esterno dell'inserto. Incubare le cellule mesenchimali piastrate a 37 °C utilizzando un incubatore al 5% di CO₂ e al 95% di aria per 1 ora per consentire alle cellule di depositarsi sulla membrana dell'inserto.
8. Trasferire l'epitelio intatto sopra la gocciolina mesenchimale placcata con lo strato di cellule basali dell'epitelio rivolto verso le cellule mesenchimali utilizzando una pipetta da 1 mL.
   NOTA: Quando si trasferisce l'epitelio alla gocciolina mesenchimale, le cellule mesenchimali non devono essere disturbate.
9. Appiattire l'epitelio intatto sopra il mesenchima per espiantare la pelle ricostituita. Lasciare uno strato sottile di terreno sull'inserto per mantenere l'espiante di pelle ricostituita semi-umido per fornire un'interfaccia aria-liquido. Incubare l'espianto cutaneo ricostituito a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ e al 95% di aria. Cambia il mezzo ogni 2 giorni.
   NOTA: Questa procedura è stata pubblicata¹³.

Risultati

Colture di espianti cutanei
Lo sviluppo delle gemme delle piume da colture di organi cutanei ex vivo può essere osservato direttamente al microscopio. Utilizzando il modello di coltura di espiantazione della pelle dorsale di pollo allo stadio 30, i placodi sono visibili lungo la linea mediana. Il fronte morfogenetico si propaga poi gradualmente lateralmente verso la periferia cutanea con la formazione di nuovi primordi della piuma. Questi primordii di piume si svilupperanno in boccioli di pi...

Discussione

La ricombinazione tissutale fornisce un saggio per esplorare i contributi unici dell'epitelio e del mesenchima. Nei polli, le piume iniziano a svilupparsi al giorno embrionale 7 (E7) mentre le squame iniziano a E9. Quando il mesenchima della squama E9 viene ricombinato con l'epitelio della piuma E7, il tessuto ricombinato forma squame e quando il mesenchima della piuma E7 viene ricombinato con l'epitelio della squama E9 si formano¹¹ penne. Questi studi hanno dimostrato che il mesenchima controlla ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042