Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

Özet

Burada, doku etkileşimlerini, 4D görüntüleme timelapse filmini (3D artı zaman), moleküler fonksiyonun küresel veya yerel bozulmasını ve sistem biyolojisi karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilecek üç tip kuş embriyonik deri eksplant kültürü için protokolleri açıklıyoruz.

Özet

Embriyogenez sırasında gelişen kuş derisi, doku modellemesi hakkında değerli bilgiler sağlayabilen benzersiz bir modeldir. Burada, cilt gelişiminin farklı yönlerini incelemek için deri eksplant kültürlerinde üç varyasyon açıklanmaktadır. İlk olarak, ex vivo organ kültürleri ve manipülasyonları, araştırmacılara tüy tomurcuklarının gelişimini doğrudan gözlemleme ve inceleme fırsatları sunar. Deri eksplant kültürü 7 gün boyunca büyüyebilir ve bu büyüme periyodu boyunca aralıklarla hücresel davranışın doğrudan analizine ve 4D görüntülemeye olanak tanır. Bu aynı zamanda doku tepkisini görselleştirmek için kültür koşullarının fiziksel ve moleküler manipülasyonlarına da izin verir. Örneğin, büyüme faktörü kaplı boncuklar, sınırlı bir alanda tüy deseninde değişikliklere neden olmak için yerel olarak uygulanabilir. Alternatif olarak, viral transdüksiyon, gen ekspresyonunu yukarı veya aşağı regüle etmek için kültür ortamında küresel olarak verilebilir. İkincisi, cilt rekombinasyon protokolü, araştırmacıların farklı cilt bölgelerinden, farklı yaşam evrelerinden veya farklı türlerden türetilen epidermis ve mezenşim arasındaki doku etkileşimlerini araştırmalarına olanak tanır. Bu, epitelin sinyallere yanıt vermeye yetkin olduğu zaman penceresini ve farklı mezenkimal kaynaklardan gelen sinyallere yanıt olarak farklı cilt uzantıları oluşturma yeteneğini test etme fırsatı verir. Üçüncüsü, sağlam epitel ile kaplanmış ayrışmış dermal hücreler kullanılarak cildin sulandırılması, cilt gelişimini sıfırlar ve periyodik modellemenin ilk süreçlerinin incelenmesini sağlar. Bu yaklaşım aynı zamanda, yeniden yapılandırılmış deri eksplantını oluşturmadan önce ayrışmış hücreler arasındaki gen ekspresyonunu manipüle etme yeteneğimizi de geliştirir. Bu makale, faydalarını göstermek için üç kültür protokolünü ve örnek deneyleri sunmaktadır.

Giriş

Kuş embriyosu derisi gelişimi, farklı desenler ve mikrocerrahi ve manipülasyona erişilebilirlik nedeniyle morfogenez mekanizmalarını incelemek için mükemmel bir modeldir ^1,2. Bununla birlikte, sağlam dokulardaki hücresel ve moleküler olayları değerlendirmek zor olabilir, çünkü yabancı dokuların varlığı mikroskobik gözlemleri zorlaştırabilir. Ayrıca, cilt morfogenezindeki rollerini test etmek için gen ekspresyonunu manipüle etme yeteneği her zaman basit bir iş değildir. Deri eksplant modellerini kullanarak daha yüksek bir başarı oranıyla retroviral transdüksiyon kullanarak gen fonksiyonlarını test edebileceğimi....

Protokol

1. Tavuk derisi eksplant kültürü (Şekil 1)

1. Döllenmiş tavuk yumurtalarını nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 38 °C'de kuluçkaya yatırın ve Hamburger ve Hamilton^14'e göre hazırlayın.
   1. Aşama 28'de (~ E5.5), uzvun ikinci basamağı ve üçüncü parmağı diğerlerinden daha uzundur; Üç basamak ve dört ayak parmağı belirgindir.
   2. Aşama 29'da (~ E6), kanat dirsekten bükülür; İkinci basamak diğerlerinden belirgin şekilde daha uzundur.
   3. Evre 30'da (~ E6.5), omuriliğin her iki yanında iki dorsal tüy tomurcuğu sırası brakiyal seviyede ve bacak ....

Tartışmalar

Doku rekombinasyonu, epitel ve mezenşimin benzersiz katkılarını keşfetmek için bir test sağlar. Tavuklarda tüyler embriyonik gün 7'de (E7) gelişmeye başlarken, pullar E9'da başlar. E9 skalası mezenşimi, E7 skalası epiteli ile yeniden birleştirildiğinde, yeniden birleşen doku pulcukları oluşturur ve E7 tüy mezenşimi, E9 skalası epitel ile yeniden birleştirildiğinde, tüyler oluşur¹¹. Bu çalışmalar, mezenkimin patern oluşumunu, aralığını ve organ kimliğini kontrol .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042