Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

Özet

Burada, doku etkileşimlerini, 4D görüntüleme timelapse filmini (3D artı zaman), moleküler fonksiyonun küresel veya yerel bozulmasını ve sistem biyolojisi karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilecek üç tip kuş embriyonik deri eksplant kültürü için protokolleri açıklıyoruz.

Özet

Embriyogenez sırasında gelişen kuş derisi, doku modellemesi hakkında değerli bilgiler sağlayabilen benzersiz bir modeldir. Burada, cilt gelişiminin farklı yönlerini incelemek için deri eksplant kültürlerinde üç varyasyon açıklanmaktadır. İlk olarak, ex vivo organ kültürleri ve manipülasyonları, araştırmacılara tüy tomurcuklarının gelişimini doğrudan gözlemleme ve inceleme fırsatları sunar. Deri eksplant kültürü 7 gün boyunca büyüyebilir ve bu büyüme periyodu boyunca aralıklarla hücresel davranışın doğrudan analizine ve 4D görüntülemeye olanak tanır. Bu aynı zamanda doku tepkisini görselleştirmek için kültür koşullarının fiziksel ve moleküler manipülasyonlarına da izin verir. Örneğin, büyüme faktörü kaplı boncuklar, sınırlı bir alanda tüy deseninde değişikliklere neden olmak için yerel olarak uygulanabilir. Alternatif olarak, viral transdüksiyon, gen ekspresyonunu yukarı veya aşağı regüle etmek için kültür ortamında küresel olarak verilebilir. İkincisi, cilt rekombinasyon protokolü, araştırmacıların farklı cilt bölgelerinden, farklı yaşam evrelerinden veya farklı türlerden türetilen epidermis ve mezenşim arasındaki doku etkileşimlerini araştırmalarına olanak tanır. Bu, epitelin sinyallere yanıt vermeye yetkin olduğu zaman penceresini ve farklı mezenkimal kaynaklardan gelen sinyallere yanıt olarak farklı cilt uzantıları oluşturma yeteneğini test etme fırsatı verir. Üçüncüsü, sağlam epitel ile kaplanmış ayrışmış dermal hücreler kullanılarak cildin sulandırılması, cilt gelişimini sıfırlar ve periyodik modellemenin ilk süreçlerinin incelenmesini sağlar. Bu yaklaşım aynı zamanda, yeniden yapılandırılmış deri eksplantını oluşturmadan önce ayrışmış hücreler arasındaki gen ekspresyonunu manipüle etme yeteneğimizi de geliştirir. Bu makale, faydalarını göstermek için üç kültür protokolünü ve örnek deneyleri sunmaktadır.

Giriş

Kuş embriyosu derisi gelişimi, farklı desenler ve mikrocerrahi ve manipülasyona erişilebilirlik nedeniyle morfogenez mekanizmalarını incelemek için mükemmel bir modeldir ^1,2. Bununla birlikte, sağlam dokulardaki hücresel ve moleküler olayları değerlendirmek zor olabilir, çünkü yabancı dokuların varlığı mikroskobik gözlemleri zorlaştırabilir. Ayrıca, cilt morfogenezindeki rollerini test etmek için gen ekspresyonunu manipüle etme yeteneği her zaman basit bir iş değildir. Deri eksplant modellerini kullanarak daha yüksek bir başarı oranıyla retroviral transdüksiyon kullanarak gen fonksiyonlarını test edebileceğimizi bulduk. Burada, geliştirilmiş olan üç cilt eksplant modelinin avantajlarını tartışıyoruz.

Kuş embriyonik deri kültürü, deri tüy tomurcuğu gelişimi sırasında hücre davranışını, gen regülasyonunu ve işlevini değerlendirmek için güçlü bir sistemdir 3,4,5,6. Tüy tomurcuğu gelişiminin moleküler mekanizmalarının, kültür ortamına yerleştirilen büyüme faktörlerinin küresel olarak eklenmesi veya bunların büyüme faktörü kaplı boncuklardan yerel olarak salınması yoluyla değerlendirilmesine izin verir. Gelişimsel düzenleyici genler, spesifik morfogenetik olaylardaki rollerini değerlendiren fonksiyonel çalışmalar için bozulmamış veya baskın negatif formların viral gen iletimi kullanılarak da manipüle edilebilir ^7,8.

Kuş epitelyal-mezenkimal rekombinasyon kültürü, araştırmacıların cilt morfogenezinin erken aşamalarında her bir cilt bileşeninin katkılarını belirlemelerini sağlar. Rawles'ın bu yaklaşımı kullanması, mezenşim ve epitel arasındaki etkileşimlerin cilt eklerinin oluşturulması için gerekli olduğunu ortaya koymuştur⁹. Mezenkim yoğuşmalar oluşturabilir ve mezenkimal yoğuşma oluşumlarını indüklemek ve sürdürmek için epitel gereklidir². Daha sonra, bu yaklaşım Pulsuz tavukların neden tüy oluşturamadığını değerlendirmek için kullanıldı. Defektin mezenkim^10'da olduğu keşfedildi. Dhouailly, farklı türlerden embriyolarda doku epitelyal-mezenkimal rekombinasyon çalışmaları yaptı. Bu çalışmalar, cilt morfogenezini destekleyen epitelyal-mezenkimal iletişime gelişimsel ve evrimsel içgörüler sağladı³.

Bu çalışma, tüy büyümesini kontrol eden faktörleri daha iyi anlamak için kullanılmıştır. Yöntem ayrıca, ön-arka eksen boyunca tüy başlangıcı, gelişimi ve uzaması sırasında meydana gelen deri desenlemesinde yer alan hücresel ve moleküler olayların görselleştirilmesini de geliştirir. Epitel mezenşimden ayrıldığında ve iki bileşen daha sonra yeniden birleştirildiğinde, yeni etkileşimler cilt desenini yeniden oluşturur. Bu yaklaşım, epidermisin mezenkimal sinyallere yanıt vermesini sağlayan mezenkimal indükleyici sinyalleri ve epitelyal yeterlilik moleküllerini^{değerlendirmemize izin verir 11}. Tüy tomurcuğu gelişimi ve desen oluşumu için gerekli olan sonraki aşağı akış moleküler ifadesi de incelenebilir. Bu çalışmalar, tomurcukların konumunun mezenşim tarafından kontrol edildiğini ortaya koymuştur. Mezenşim ile rekombinasyondan önce epitelin 90^o dönmesi, tüy tomurcuğu uzama yönünün epitel tarafından kontrol edildiğini gösterir. Bu yöntem, tüy tomurcuğu oryantasyonunu düzenleyen moleküler mekanizmayı incelememiz için gerekliydi¹².

Deri mezenşiminin yüksek hücre yoğunluğunda kaplamadan önce tek hücrelere ayrıldığı ve sağlam epitel ile kaplandığı kuş derisi sulandırma kültürü, dermal hücreleri ilkel bir duruma sıfırlar. Eksplant daha sonra önceki ipuçlarından bağımsız olarak yeni bir periyodik model oluşturmak için kendi kendini organize eder¹³. Bu cilt sulandırma modeli, tüy periyodik desenlemenin ilk süreçlerini incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşımı, mezenkimal hücrelerin tek bir epitel parçasına oranının modüle edilmesinin tüy tomurcuklarının boyutunu veya sayısını nasıl etkileyebileceğini keşfetmek için kullandık. Mezenkimal hücrelerin oranı arttıkça tomurcuk sayısının arttığı, ancak tomurcukların boyutunun artmadığı bulundu. Bu yaklaşımın bir başka avantajı, mezenkimal hücre viral transdüksiyonunun diğer iki kültür koşuluna göre daha yüksek verimlilik göstermesi ve daha belirgin fenotipler üretebilmesidir.

Protokol

1. Tavuk derisi eksplant kültürü (Şekil 1)

1. Döllenmiş tavuk yumurtalarını nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 38 °C'de kuluçkaya yatırın ve Hamburger ve Hamilton^14'e göre hazırlayın.
   1. Aşama 28'de (~ E5.5), uzvun ikinci basamağı ve üçüncü parmağı diğerlerinden daha uzundur; Üç basamak ve dört ayak parmağı belirgindir.
   2. Aşama 29'da (~ E6), kanat dirsekten bükülür; İkinci basamak diğerlerinden belirgin şekilde daha uzundur.
   3. Evre 30'da (~ E6.5), omuriliğin her iki yanında iki dorsal tüy tomurcuğu sırası brakiyal seviyede ve bacak seviyesinde üç sıra görülür.
   4. Aşama 31'de (~ E7), jumbo-sakral seviyelerde ~ 7 sıra tüy vardır.
   5. 32. aşamada, bacak seviyesinde on bir veya daha fazla sıra tüy tomurcuğu bulunur.
2. Hanks'in tamponlu tuzlu su çözeltisi (HBSS) veya fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 60 mm'lik bir Petri kabına 28-32 evre bir tavuk embriyosu yerleştirin.
   1. Embriyo sırt derisini alt boyun ile kuyruk bölgesi arasında inceleyin. Kafayı boyundan çıkarmak için makas kullanın. Uzantılar dışa doğru yayılacak şekilde vücudun ventral tarafını aşağı doğru konumlandırmak için uzuv tomurcuklarını nazikçe çekin.
   2. Saatçinin forsepslerini veya keskin yaylı makası kullanarak embriyo gövdesinin iki yan tarafı boyunca deride önden arkaya bir kesi yapın. Uzuv tomurcuklarını uzunlamasına sıkıştırarak vücudu bir çift forseps ile stabilize ettiğinizden emin olun. Saatçinin forsepslerini kullanarak cildi boyundan kuyruk bölgesine veya kuyruktan boyuna kadar nazikçe soyun.
3. Soyulmuş cilde bağlı kalan deri altı dokuları nazikçe çıkarın ve keskin yaylı makasla cildin kenarlarını düzeltin.
4. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve Penisilin / streptomisin çözeltisi (1:100 seyreltilmiş) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerinden (DMEM) 2 mL / kuyucuğu 6 oyuklu bir tabakta bir kuyuya ekleyin. Besiyeri ve antibiyotikler eklendikten sonra, ortam kültür ekinin dışında olacak şekilde kuyucuğun içine steril bir doku kültürü eki yerleştirin.
5. Cildi bir spatula ile epidermis yukarı bakacak ve mezenkim iç zarı aşağı bakacak şekilde kültür ekine aktarın. Cildin herhangi bir kırışıklık olmadan düz durmasını sağlamak için, cildi HBSS'deki spatulanın üzerine çekin. Cildin katlanmadan transferini kolaylaştırmak için cildi sıvı ile spatuladan kaydırın.
6. 200 μL'lik bir pipet ile kültür ekindeki fazla HBSS'yi çıkarın. Bir hava-sıvı arayüzü sağlamak için eksplantı yarı ıslak tutmak için kültür ekinin içinde ince bir HBSS tabakası bırakın.
7. Deri eksplant kültürlerini %5 CO₂ ve% 95 hava kullanarak 37 ° C'de inkübe edin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
   NOT: Bu prosedür yayınlanmıştır⁴. Bu kültür sistemi, bıldırcın veya ispinoz derisi eksplant kültürleri gibi diğer kuşların derileri ile de kullanılabilir.

2. Tavuk derisi epitelyal-mezenkimal rekombinasyon (Şekil 2)

1. Döllenmiş tavuk yumurtalarını 38 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın ve embriyoları Hamburger ve Hamilton^14'e göre evrelendirin (bölüm 1.1).
2. % 0.25 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tamponu ile 2 adet kalsiyum-magnezyum içermeyen (CMF) salin hazırlayın.
   1. 10x CMF tamponu yapın (NaCl (1.37 M) 80 g, KCl (0.04 M) 3 g, NaH₂PO4 (0.004 M) 0.5 g, KH₂PO4 (2 M) 0.25 g, NaHCO₃ (0.12 M) 10 g, glikoz (0.1 M) 20 g 1.000 mL damıtılmış suda. PH'ı 7.3'e ayarlayın. % 0.25 EDTA tamponu ile 100 mL 2x CMF yapmak için, EDTA önce 80 mL damıtılmış su içinde çözülmeli, daha sonra% 0.25 EDTA çalışma çözeltisi ile 2x CMF yapmak için 20 mL 10x CMF tamponu eklenmelidir.
3. Evre 30-32 tavuk embriyo dorsal derilerini yukarıda tarif edildiği gibi HBSS'de diseke edin (bölüm 1.2) ve bunları buz üzerinde% 0.25 EDTA ile 2x CMF salin içinde 15-20 dakika inkübe edin.
4. Saatçinin forsepslerini kullanarak epitel ve mezenkimi dikkatlice ayırın. Ayrılan epitel ve mezenşimi HBSS içeren temiz bir kaba aktarın.
5. Önce mezenşimi HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirerek epiteli mezenşim ile yeniden birleştirin, ardından epiteli mezenşimin üzerine yerleştirin. Epiteli mezenşim ile aynı ön-arka eksen boyunca yerleştirin veya hangi bileşenin cilt morfogenezinin farklı yönlerini düzenlediğini belirlemek için epiteli mezenşimin ön-arka ekseninden 90^o çevirin.
6. Yeniden birleştirilmiş derileri, büyüme için 6 oyuklu kültür kaplarındaki kültür eklerine aktarın ve yeniden birleştirilmiş derinin etrafındaki fazla HBSS'yi çıkarın.
7. Ek parçanın dışındaki kuyucuğa% 10 FBS ile 2 mL DMEM kültür ortamı yerleştirin. Bir hava-sıvı arayüzü sağlamak üzere eksplantı yarı ıslak tutmak için ekleme haznesinin içine ince bir DMEM tabakası yerleştirin.
8. Cilt rekombinantlarını 37 ° C'de% 5 CO₂ ve% 95 hava karışımı içinde inkübe edin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin. Diseksiyon mikroskobuna monte edilmiş bir kamera ile hızlandırılmış fotoğrafçılık kullanarak cilt gelişiminin ilk cilt aşamalarındaki fenotipik değişiklikleri belgeleyin.
   NOT: Bu prosedür yayınlanmıştır¹¹.

3. Tavuk derisinin sulandırılması (Şekil 3)

1. Döllenmiş tavuk yumurtalarını 38 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın ve embriyoları Hamburger ve Hamilton^14'e göre evrelendirin (bölüm 1.1).
2. HBSS'de evre 30-33 tavuk embriyo dorsal derilerini inceleyin. Derileri, yukarıda açıklandığı gibi buz üzerinde 15-20 dakika boyunca% 0.25 EDTA ile 2x CMF salin içinde inkübe edin (bölüm 2.3).
3. Saatçinin forsepslerini kullanarak epitel ve mezenkimi dikkatlice ayırın. Ayrılan epitel ve mezenkimi buz üzerinde HBSS'ye aktarın.
   NOT: Epiteli mezenşimden ayırırken epitelin bazal tabakasına zarar vermemeye dikkat edin.
4. Ayrılan mezenşimi 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve PBS'de yapılan %0.1 kollajenaz / tripsin çözeltisi ile 37 ° C'lik bir su banyosunda 10-15 dakika inkübe edin.
5. Tek hücreli bir süspansiyon yapmak için cilt mezenşimini bir Pasteur pipeti ile ayırın. Sindirimi durdurmak için% 10 FBS ile DMEM ekleyin.
6. Hücreleri 5 dakika boyunca 233 × g'da pelet ve santrifüjleyin. Hücreleri 2 × 10⁷ hücre / mL konsantrasyonda kültür ortamı ile yeniden süspanse etti.
   NOT: Bu adımda, mezenkimal hücreler, gen transdüksiyonu için buz üzerinde 2-3 saat boyunca virüs içeren ortamda yeniden süspanse edilebilir.
7. 6 oyuklu bir tabağın bir oyuğuna bir hücre kültürü eki yerleştirin. Doku kültürü ekine 10 μL 2 × 10⁷ hücre / mL mezenkimal hücre bırakın. Ekin dışındaki kuyucuğa% 10 FBS içeren 2 ml DMEM kültür ortamı yerleştirin. Kaplanmış mezenkimal hücreleri, hücrelerin insert membranına yerleşmesine izin vermek için% 5 CO₂ ve% 95 hava inkübatörü kullanarak 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
8. Sağlam epiteli, 1 mL'lik bir pipet kullanarak epitel bazal hücre tabakası mezenkimal hücrelere bakacak şekilde kaplanmış mezenkimal damlacığın üzerine aktarın.
   NOT: Epitel mezenkimal damlacığa aktarılırken, mezenkimal hücreler rahatsız edilmemelidir.
9. Sulandırılmış cildin eksplant yapmasını sağlamak için sağlam epiteli mezenşim üzerinde düzleştirin. Hava-sıvı bir arayüz sağlamak için sulandırılmış cilt eksplantını yarı ıslak tutmak için ek parça üzerinde ince bir ortam tabakası bırakın. Sulandırılmış deri eksplantını 37 °C'de %5 CO₂ ve %95 hava inkübatörde inkübe edin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
   NOT: Bu prosedür yayınlanmıştır¹³.

Sonuçlar

Deri eksplant kültürleri
Ex vivo deri organ kültürlerinden tüy tomurcuğu gelişimi doğrudan mikroskop altında gözlemlenebilir. Tavuk evre 30 sırt derisinin deri eksplant kültürü modelini kullanarak, plakodlar orta hat boyunca görülebilir. Morfogenetik cephe daha sonra yeni tüy primordia oluşumu ile cilt çevresine doğru yavaş yavaş yanal olarak yayılır. Bu tüy primordiaları, kültürde 2 gün sonra kısa tüy tomurcuklarına ve kültürde 4 gün sonra uzun tüy tomurcu...

Tartışmalar

Doku rekombinasyonu, epitel ve mezenşimin benzersiz katkılarını keşfetmek için bir test sağlar. Tavuklarda tüyler embriyonik gün 7'de (E7) gelişmeye başlarken, pullar E9'da başlar. E9 skalası mezenşimi, E7 skalası epiteli ile yeniden birleştirildiğinde, yeniden birleşen doku pulcukları oluşturur ve E7 tüy mezenşimi, E9 skalası epitel ile yeniden birleştirildiğinde, tüyler oluşur¹¹. Bu çalışmalar, mezenkimin patern oluşumunu, aralığını ve organ kimliğini kontrol ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042