使用禽皮肤外植体研究组织模式和器官发生

摘要

在这里，我们描述了三种类型的禽胚胎皮肤外植体培养物的方案，可用于检查组织相互作用、4D 成像延时电影（3D 加时间）、分子功能的全局或局部扰动以及系统生物学表征。

摘要

在胚胎发生过程中发育的鸟类皮肤是一个独特的模型，可以为组织模式化提供有价值的见解。这里描述了皮肤外植体培养的三种变体，以检查皮肤发育的不同方面。首先， 离体 器官培养和操作为研究人员提供了直接观察和研究羽毛芽发育的机会。皮肤外植体培养物可以生长 7 天，从而能够直接分析细胞行为并在此生长期间每隔一段时间进行 4D 成像。这还允许对培养条件进行物理和分子操作，以可视化组织反应。例如，生长因子包被的珠子可以局部应用，以在有限的区域内诱导羽毛图案的变化。或者，病毒转导可以在培养基中在全球范围内递送，以上调或下调基因表达。其次，皮肤重组方案使研究人员能够研究表皮和间充质之间的组织相互作用，这些相互作用来自不同的皮肤区域、不同的生命阶段或不同的物种。这提供了一个机会来测试上皮细胞能够对信号做出反应的时间窗口，以及它形成不同皮肤附属物以响应来自不同间充质来源的信号的能力。第三，使用与完整上皮细胞覆盖的解离真皮细胞进行皮肤重建，可以重置皮肤发育，并能够研究周期性图案的初始过程。这种方法还增强了我们在创建重建的皮肤外植体之前操纵解离细胞中基因表达的能力。本文提供了三种培养方案和示例实验来证明其实用性。

引言

禽胚胎皮肤发育是研究形态发生机制的极好模型，因为它具有独特的模式以及显微外科手术和操作的可及性^1,2。然而，评估完整组织中的细胞和分子事件可能很困难，因为外来组织的存在会使显微镜观察复杂化。此外，操纵基因表达以测试其在皮肤形态发生中的作用的能力并不总是一项简单的任务。我们发现我们可以使用逆转录病毒转导来测试基因功能，使用皮肤外植体模型具有更高的成功率。在这里，我们讨论了已经开发的三种皮肤外植体模型的优点。

禽胚胎皮肤培养是一种强大的系统，用于评估皮肤羽毛芽发育过程中的细胞行为、基因调控和功能3,4,5,6。它允许通过在培养基中放置生长因子的全局添加或它们从生长因子包被的珠子中局部释放来评估羽毛芽发育的分子机制。发育调控基因也可以使用完整或显性阴性形式的病毒基因转导进行操作，用于功能研究，评估它们在特定形态发生事件中的作用 ^7,8。

研究方案

1.鸡皮外植体培养（图1）

1. 在38°C的加湿培养箱中孵育受精的鸡蛋，并根据汉堡和汉密尔顿¹⁴进行分期。
   1. 在第 28 阶段 （~E5.5），肢体的第二趾和第三脚趾比其他趾长;三个手指和四个脚趾是不同的。
   2. 在第 29 阶段 （~E6），机翼在肘部弯曲;第二个数字明显比其他数字长。
   3. 在第 30 阶段 （~E6.5），在肱水平上可以看到脊髓两侧的两个背羽芽行，在腿水平上可以看到三排。
   4. 在第 31 阶段 （~E7），在巨骶层有 ~7 排羽毛。
   5. 在第 32 阶段，在腿的水平上存在 11 行或更多行的羽毛芽。
2. 将阶段 28-32 鸡胚胎放入含有 Hanks 缓冲盐水溶液 （HBSS） 或磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 60 mm 培养皿中。
   1. 解剖下颈部到尾部区域之间的胚胎背侧皮肤。用剪刀将头部从颈部取下。轻轻拉动肢芽，将身体的腹侧向下放置，使附属物向外展开。
   2. 使用钟表匠的镊子或锋利的弹簧剪刀在胚胎体的两侧沿着皮肤做一个从前到后的切口。一定要用一把镊子纵向捏住肢芽来稳定身体。使用钟表师的镊子轻轻从颈部到尾部区域或从尾部到颈部轻轻剥离皮肤。

讨论

组织重组提供了一种探索上皮细胞和间充质独特贡献的测定方法。在鸡中，羽毛在胚胎第 7 天 （E7） 开始发育，而鳞片从 E9 开始发育。当E9鳞片间充质与E7羽毛上皮重组时，重组组织形成鳞片，当E7羽毛间充质与E9鳞片上皮羽毛重组时形成¹¹。这些研究表明，间充质控制着模式形成、间距和器官身份。当然，上皮细胞必须有能力能够适当地接收和解释间充质信号。能力只存在于上?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042