使用禽皮肤外植体研究组织模式和器官发生

摘要

在这里，我们描述了三种类型的禽胚胎皮肤外植体培养物的方案，可用于检查组织相互作用、4D 成像延时电影（3D 加时间）、分子功能的全局或局部扰动以及系统生物学表征。

摘要

在胚胎发生过程中发育的鸟类皮肤是一个独特的模型，可以为组织模式化提供有价值的见解。这里描述了皮肤外植体培养的三种变体，以检查皮肤发育的不同方面。首先， 离体 器官培养和操作为研究人员提供了直接观察和研究羽毛芽发育的机会。皮肤外植体培养物可以生长 7 天，从而能够直接分析细胞行为并在此生长期间每隔一段时间进行 4D 成像。这还允许对培养条件进行物理和分子操作，以可视化组织反应。例如，生长因子包被的珠子可以局部应用，以在有限的区域内诱导羽毛图案的变化。或者，病毒转导可以在培养基中在全球范围内递送，以上调或下调基因表达。其次，皮肤重组方案使研究人员能够研究表皮和间充质之间的组织相互作用，这些相互作用来自不同的皮肤区域、不同的生命阶段或不同的物种。这提供了一个机会来测试上皮细胞能够对信号做出反应的时间窗口，以及它形成不同皮肤附属物以响应来自不同间充质来源的信号的能力。第三，使用与完整上皮细胞覆盖的解离真皮细胞进行皮肤重建，可以重置皮肤发育，并能够研究周期性图案的初始过程。这种方法还增强了我们在创建重建的皮肤外植体之前操纵解离细胞中基因表达的能力。本文提供了三种培养方案和示例实验来证明其实用性。

引言

禽胚胎皮肤发育是研究形态发生机制的极好模型，因为它具有独特的模式以及显微外科手术和操作的可及性^1,2。然而，评估完整组织中的细胞和分子事件可能很困难，因为外来组织的存在会使显微镜观察复杂化。此外，操纵基因表达以测试其在皮肤形态发生中的作用的能力并不总是一项简单的任务。我们发现我们可以使用逆转录病毒转导来测试基因功能，使用皮肤外植体模型具有更高的成功率。在这里，我们讨论了已经开发的三种皮肤外植体模型的优点。

禽胚胎皮肤培养是一种强大的系统，用于评估皮肤羽毛芽发育过程中的细胞行为、基因调控和功能3,4,5,6。它允许通过在培养基中放置生长因子的全局添加或它们从生长因子包被的珠子中局部释放来评估羽毛芽发育的分子机制。发育调控基因也可以使用完整或显性阴性形式的病毒基因转导进行操作，用于功能研究，评估它们在特定形态发生事件中的作用 ^7,8。

禽上皮-间充质重组培养 使研究人员能够确定每种皮肤成分在皮肤形态发生的早期阶段的贡献。罗尔斯（Rawles）对这种方法的使用揭示了间充质和上皮之间的相互作用对于形成皮肤附属物至关重要⁹。间充质可以形成凝结，需要上皮来诱导和维持间充质凝结的形成².后来，这种方法被用来评估 为什么无鳞 鸡无法形成羽毛。发现缺陷位于间充质¹⁰ 中。Dhouailly对不同物种的胚胎进行了组织上皮-间充质重组研究。这些研究为促进皮肤形态发生的上皮-间充质通讯提供了发育和进化的见解³.

这项研究被用来更好地了解控制羽毛生长的因素。该方法还改善了在羽毛起始、发育和沿前后轴伸长过程中发生的皮肤图案中涉及的细胞和分子事件的可视化。当上皮细胞与间充质分离，然后将两种成分重新组合时，新的相互作用会重新建立皮肤模式。这种方法使我们能够评估间充质诱导信号和上皮能力分子，这些信号和上皮能力分子使表皮能够对间充质信号做出反应¹¹。还可以检查羽毛芽发育和模式形成所需的后续下游分子表达。这些研究已经确定，芽的位置是由间充质控制的。在与间充质重组之前，上皮细胞的旋转 90^o 表明羽毛芽伸长的方向受上皮细胞的控制。该方法对于我们研究调控羽毛芽取向的分子机制至关重要¹²。

禽皮肤重建培养，其中皮肤间充质解离为单细胞，然后以高细胞密度铺板并覆盖完整的上皮，将真皮细胞重置为原始状态。然后，外植体自我组织，形成独立于先前线索的新周期性模式¹³。这种皮肤重建模型可用于研究羽毛周期性图案的初始过程。我们使用这种方法来探索调节间充质细胞与单块上皮细胞的比例如何影响羽毛芽的大小或数量。发现随着间充质细胞比例的增加，芽的数量增加，但芽的大小没有增加。这种方法的另一个优点是，间充质细胞病毒转导比其他两种培养条件显示出更高的效率，并且可以产生更明显的表型。

研究方案

1.鸡皮外植体培养（图1）

1. 在38°C的加湿培养箱中孵育受精的鸡蛋，并根据汉堡和汉密尔顿¹⁴进行分期。
   1. 在第 28 阶段 （~E5.5），肢体的第二趾和第三脚趾比其他趾长;三个手指和四个脚趾是不同的。
   2. 在第 29 阶段 （~E6），机翼在肘部弯曲;第二个数字明显比其他数字长。
   3. 在第 30 阶段 （~E6.5），在肱水平上可以看到脊髓两侧的两个背羽芽行，在腿水平上可以看到三排。
   4. 在第 31 阶段 （~E7），在巨骶层有 ~7 排羽毛。
   5. 在第 32 阶段，在腿的水平上存在 11 行或更多行的羽毛芽。
2. 将阶段 28-32 鸡胚胎放入含有 Hanks 缓冲盐水溶液 （HBSS） 或磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 60 mm 培养皿中。
   1. 解剖下颈部到尾部区域之间的胚胎背侧皮肤。用剪刀将头部从颈部取下。轻轻拉动肢芽，将身体的腹侧向下放置，使附属物向外展开。
   2. 使用钟表匠的镊子或锋利的弹簧剪刀在胚胎体的两侧沿着皮肤做一个从前到后的切口。一定要用一把镊子纵向捏住肢芽来稳定身体。使用钟表师的镊子轻轻从颈部到尾部区域或从尾部到颈部轻轻剥离皮肤。
3. 轻轻去除仍然附着在脱皮皮肤上的皮下组织，并用锋利的弹簧剪刀抚平皮肤边缘。
4. 将 2 mL/孔补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和青霉素/链霉素溶液（1:100 稀释）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 加入 6 孔培养皿中的孔中。加入培养基和抗生素后，将无菌组织培养插入物放入孔内，使培养基位于培养物插入物的外部。
5. 用刮刀将皮肤转移到培养插入物上，表皮朝上，间充质面朝下，插入膜上。为确保皮肤平坦无皱纹，请在 HBSS 中将皮肤拉到刮刀上。用液体将皮肤从刮刀上滑下，以促进皮肤的转移而不折叠。
6. 用 200 μL 移液管从培养插入物中去除多余的 HBSS。在培养插入物内留下一层薄薄的 HBSS，以保持外植体半湿，以提供气液界面。
7. 在37°C下使用5%CO₂ 和95%空气孵育皮肤外植体培养物。每 2 天更换一次培养基。
   注意:此过程已发布⁴.该培养系统也可用于其他鸟类的皮肤，如鹌鹑或雀类皮肤外植体培养物。

2.鸡皮上皮-间充质重组（图2）

1. 在38°C的潮湿培养箱中孵育受精的鸡蛋，并根据汉堡和汉密尔顿¹⁴ （第1.1节）对胚胎进行分期。
2. 用 0.25% 乙二胺四乙酸 （EDTA） 缓冲液制备 2x 无钙镁 （CMF） 盐水。
   1. 制备10x CMF缓冲液（NaCl（1.37M）80g，KCl（0.04M）3g，NaH₂PO 4（0.004M）0.5g，KH₂PO 4（2M）0.25g，NaHCO₃ （0.12M）10g，葡萄糖（0.1M）20g在1,000mL蒸馏水中。将 pH 值调节至 7.3。要用0.25%EDTA缓冲液制备100 mL 2x CMF，应先将EDTA溶解在80 mL蒸馏水中，然后加入20 mL 10x CMF缓冲液，用0.25%EDTA工作溶液制备2x CMF。
3. 如上所述（第1.2节）在HBSS中解剖30-32个鸡胚背皮，并将它们在2x CMF盐水中用0.25%EDTA在冰上孵育15-20分钟。
4. 使用钟表匠的镊子小心地分离上皮和间充质。将分离的上皮细胞和间充质转移到含有HBSS的干净培养皿中。
5. 首先将间充质放在含有HBSS的培养皿上，然后将上皮细胞与间充质重新结合，然后将上皮细胞放在间充质的顶部。将上皮沿与间充质相同的前后轴放置，或将上皮从间充质的前后轴旋转 90^o ，以确定哪种成分调节皮肤形态发生的不同方面。
6. 将重组的皮肤转移到 6 孔培养皿中的培养插入物中进行生长，并去除重组皮肤周围多余的 HBSS。
7. 将 2 mL 含有 10% FBS 的 DMEM 培养基放入插入物外的孔中。在插入室内放置一层薄薄的 DMEM，以保持外植体半湿，以提供气液界面。
8. 在37°C的5%CO₂ 和95%空气的混合物中孵育皮肤重组体。每 2 天更换一次培养基。使用安装在解剖显微镜上的相机进行延时摄影，记录皮肤发育初始皮肤阶段的表型变化。
   注意:此过程已发布¹¹.

3. 鸡皮重建（图3）

1. 在38°C的潮湿培养箱中孵育受精的鸡蛋，并根据汉堡和汉密尔顿¹⁴ （第1.1节）对胚胎进行分期。
2. 在 HBSS 中解剖 30-33 阶段鸡胚背皮。如上所述，将皮肤在含有0.25%EDTA的2x CMF盐水中在冰上孵育15-20分钟（第2.3节）。
3. 使用钟表匠的镊子小心地分离上皮和间充质。将分离的上皮细胞和间充质转移到冰上的HBSS中。
   注意:在将上皮与间充质分离时，注意不要损坏上皮的基底层。
4. 将分离的间充质收集在15mL离心管中，并在37°C水浴中与PBS中制备的0.1%胶原酶/胰蛋白酶溶液孵育10-15分钟。
5. 用巴斯德移液管解离皮肤间充质，制成单细胞悬浮液。加入含有 10% FBS 的 DMEM 以停止消化。
6. 将细胞沉淀并以 233 × g 离心 5 分钟。用浓度为 2 × 10⁷ 个细胞/mL 的培养基重悬细胞。
   注意:在此步骤中，间充质细胞也可以在含病毒的培养基中在冰上重悬2-3小时以进行基因转导。
7. 将细胞培养插入物放入 6 孔培养皿的一个孔中。将 10 μL 的 2 × 10⁷ 个细胞/mL 间充质细胞滴在组织培养插入物上。将 2 ml 含有 10% FBS 的 DMEM 培养基放入插入物外的孔中。使用5%CO₂ 和95%空气培养箱在37°C下孵育接种的间充质细胞1小时，以使细胞沉降在插入膜上。
8. 使用 1 mL 移液管将完整的上皮转移到铺板的间充质液滴顶部，使上皮基底细胞层朝向间充质细胞。
   注意:当将上皮转移到间充质液滴时，不应干扰间充质细胞。
9. 将完整的上皮压平在间充质上，使重建的皮肤外植体。在插入物上留有一层薄薄的培养基，以保持重建的皮肤外植体半湿，以提供气液界面。在37°C的5%CO₂ 和95%空气培养箱中孵育重建的皮肤外植体。每 2 天更换一次培养基。
   注意:此过程已发布¹³.

结果

皮肤外植体培养
从离体皮肤器官培养物中可以直接在显微镜下观察到羽毛芽的发育。使用鸡第 30 阶段背皮的皮肤外植体培养模型，沿中线可以看到斑块。然后，形态发生前沿逐渐向皮肤周边横向传播，形成新的羽毛原基。这些羽毛原基在培养 2 天后会发育成短羽毛芽，培养 4 天后会发育成长羽毛芽（图 1）。

皮肤重组培养

讨论

组织重组提供了一种探索上皮细胞和间充质独特贡献的测定方法。在鸡中，羽毛在胚胎第 7 天 （E7） 开始发育，而鳞片从 E9 开始发育。当E9鳞片间充质与E7羽毛上皮重组时，重组组织形成鳞片，当E7羽毛间充质与E9鳞片上皮羽毛重组时形成¹¹。这些研究表明，间充质控制着模式形成、间距和器官身份。当然，上皮细胞必须有能力能够适当地接收和解释间充质信号。能力只存在于上?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042