鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

要約

ここでは、組織相互作用、4Dイメージング、タイムラプス動画(3Dプラス時間)、分子機能のグローバルまたはローカル摂動、およびシステム生物学の特性評価を調べるために使用できる3種類の鳥類胚性皮膚外植片培養のプロトコルについて説明します。

要約

胚発生中の鳥類の皮膚の発達は、組織のパターン形成に関する貴重な洞察を提供できるユニークなモデルです。ここでは、皮膚の発達のさまざまな側面を調べるための皮膚外植片培養の3つのバリエーションについて説明します。まず、 生体外 臓器の培養と操作により、研究者は羽芽の発達を直接観察し研究する機会を得ることができます。皮膚外植片培養は7日間成長するため、この成長期間中、細胞の挙動を直接分析し、間隔を空けて4Dイメージングを行うことができます。これにより、培養条件の物理的および分子的な操作が可能になり、組織の応答を視覚化することもできます。例えば、成長因子でコーティングされたビーズを局所的に適用して、限られた領域での羽毛パターンの変化を誘導することができます。あるいは、ウイルス形質導入を培地でグローバルに導入し、遺伝子発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることもできます。第二に、皮膚組換えプロトコルにより、研究者は、異なる皮膚領域、異なるライフステージ、または異なる種に由来する表皮と間葉との間の組織相互作用を調査することができます。これにより、上皮が信号に応答する能力を持つ時間枠と、さまざまな間葉系源からの信号に応答してさまざまな皮膚付属器を形成する能力をテストする機会が得られます。第三に、解離した真皮細胞に無傷の上皮を重ねて皮膚を再構成すると、皮膚の発達がリセットされ、周期的なパターン形成の初期過程の研究が可能になります。このアプローチは、再構成された皮膚外植片を作成する前に、解離した細胞間の遺伝子発現を操作する能力も強化します。この論文では、3つの培養プロトコルと、その有用性を実証するための例示的な実験を提供します。

概要

鳥類の胚の皮膚発生は、明確なパターンとマイクロサージェリーおよび操作へのアクセスのしやすさから、形態形成のメカニズムを研究するための優れたモデルです^1,2。しかし、無傷の組織における細胞イベントや分子イベントの評価は、外部組織の存在が顕微鏡観察を複雑にする可能性があるため、困難な場合があります。さらに、遺伝子発現を操作して皮膚の形態形成における遺伝子の役割を検証する能力は、必ずしも簡単な作業ではありません。私たちは、レトロウイルス形質導入を使用して遺伝子機能をテストでき、皮膚外植片モデルを使用してより高い成功率でテストできることを発見しました。ここでは、開発された3つのスキンエクスプラントモデルの利点について説明します。

鳥類胚性皮膚培養は、皮膚の羽芽発生中の細胞の挙動、遺伝子調節、および機能を評価するための強力なシステムです3,4,5,6。これにより、培地に配置された成長因子の全球的な添加または成長因子でコーティングされたビーズからの局所的な放出を通じて、羽芽発生の分子メ....

プロトコル

1. 鶏皮外植片培養(図1)

1. 受精した鶏の卵を加湿インキュベーターで38°Cでインキュベートし、Hamburger and Hamilton¹⁴に従ってステージングします。
   1. ステージ 28 (~E5.5) では、四肢の 2 番目の指と 3 番目の指は他の指よりも長くなります。3本の数字と4本の足の指は区別されます。
   2. ステージ 29 (~E6) では、翼は肘で曲がります。2 桁目は他の桁よりも明らかに長いです。
   3. ステージ30(~E6.5)では、上腕レベルでは脊髄の両側に2列の背側羽芽列が見え、脚の高さでは3列が見られます。
   4. ステージ31(~E7)では、ジャンボ仙骨レベルに~7列の羽があります。
   5. ステージ32では、脚の高さに11列以上の羽芽が存在します。
2. ステージ28-32のニワトリ胚を、ハンクス緩衝生理食塩水(HBSS)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が入った60mmのシャーレに入れます。
   1. 首の下から尾の領域まで胚の背側の皮膚を解剖します。はさみを使って首から頭を取り除きます。手足のつぼみをそっと引っ張って、付属肢を外側に広げて体の腹側を下向きに....

結果

皮膚外植片培養
ex vivo皮膚器官培養物からの羽芽の発達は、顕微鏡下で直接観察できます。ニワトリのステージ30の背側の皮膚の皮膚外植片培養モデルを使用すると、プラコードは正中線に沿って見えます。その後、形態形成前線は徐々に皮膚周辺に向かって横方向に伝播し、新しい羽毛原基が形成されます。これらの羽毛原基は、培養2日後に短い羽芽に成長し、培養4?.......

ディスカッション

組織組換えは、上皮と間葉のユニークな寄与を探求するためのアッセイを提供します。ニワトリでは、羽毛は胚の7日目(E7)に発達し始め、鱗はE9から始まります。E9スケール間葉がE7羽毛上皮と再結合されると、再結合された組織は鱗屑を形成し、E7フェザー間葉がE9スケール上皮と再結合されると、羽毛が形成される¹¹。これらの研究は、間葉がパターン形成、間隔、および?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042