鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

要約

ここでは、組織相互作用、4Dイメージング、タイムラプス動画(3Dプラス時間)、分子機能のグローバルまたはローカル摂動、およびシステム生物学の特性評価を調べるために使用できる3種類の鳥類胚性皮膚外植片培養のプロトコルについて説明します。

要約

胚発生中の鳥類の皮膚の発達は、組織のパターン形成に関する貴重な洞察を提供できるユニークなモデルです。ここでは、皮膚の発達のさまざまな側面を調べるための皮膚外植片培養の3つのバリエーションについて説明します。まず、 生体外 臓器の培養と操作により、研究者は羽芽の発達を直接観察し研究する機会を得ることができます。皮膚外植片培養は7日間成長するため、この成長期間中、細胞の挙動を直接分析し、間隔を空けて4Dイメージングを行うことができます。これにより、培養条件の物理的および分子的な操作が可能になり、組織の応答を視覚化することもできます。例えば、成長因子でコーティングされたビーズを局所的に適用して、限られた領域での羽毛パターンの変化を誘導することができます。あるいは、ウイルス形質導入を培地でグローバルに導入し、遺伝子発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることもできます。第二に、皮膚組換えプロトコルにより、研究者は、異なる皮膚領域、異なるライフステージ、または異なる種に由来する表皮と間葉との間の組織相互作用を調査することができます。これにより、上皮が信号に応答する能力を持つ時間枠と、さまざまな間葉系源からの信号に応答してさまざまな皮膚付属器を形成する能力をテストする機会が得られます。第三に、解離した真皮細胞に無傷の上皮を重ねて皮膚を再構成すると、皮膚の発達がリセットされ、周期的なパターン形成の初期過程の研究が可能になります。このアプローチは、再構成された皮膚外植片を作成する前に、解離した細胞間の遺伝子発現を操作する能力も強化します。この論文では、3つの培養プロトコルと、その有用性を実証するための例示的な実験を提供します。

概要

鳥類の胚の皮膚発生は、明確なパターンとマイクロサージェリーおよび操作へのアクセスのしやすさから、形態形成のメカニズムを研究するための優れたモデルです^1,2。しかし、無傷の組織における細胞イベントや分子イベントの評価は、外部組織の存在が顕微鏡観察を複雑にする可能性があるため、困難な場合があります。さらに、遺伝子発現を操作して皮膚の形態形成における遺伝子の役割を検証する能力は、必ずしも簡単な作業ではありません。私たちは、レトロウイルス形質導入を使用して遺伝子機能をテストでき、皮膚外植片モデルを使用してより高い成功率でテストできることを発見しました。ここでは、開発された3つのスキンエクスプラントモデルの利点について説明します。

鳥類胚性皮膚培養は、皮膚の羽芽発生中の細胞の挙動、遺伝子調節、および機能を評価するための強力なシステムです3,4,5,6。これにより、培地に配置された成長因子の全球的な添加または成長因子でコーティングされたビーズからの局所的な放出を通じて、羽芽発生の分子メカニズムの評価が可能になります。発生制御遺伝子は、特定の形態形成イベントにおけるそれらの役割を評価する機能研究のために、無傷またはドミナントネガティブ型のウイルス遺伝子導入を使用して操作することもできます^7,8。

鳥類の上皮間葉組換え培養 により、研究者は皮膚形態形成の初期段階における各皮膚成分の寄与を判断できます。Rawlesによるこのアプローチの使用により、間葉と上皮との間の相互作用が皮膚付属器の形成に不可欠であることが明らかになった⁹。間葉は凝縮を形成する可能性があり、上皮は間葉系凝縮形成を誘導および維持するために必要です²。その後、このアプローチは、 スケールレス ニワトリが羽毛を形成できない理由を評価するために使用されました。この欠陥は間葉¹⁰にあることが発見されました。Dhouaillyは、異なる種の胚で組織上皮間葉系組換え研究を実施しました。これらの研究は、皮膚の形態形成を促進する上皮間葉系コミュニケーションに関する発生的および進化的洞察を提供しました³。

この研究は、羽毛の成長を制御する要因をよりよく理解するために使用されました。また、この手法は、羽毛の開始、発生、および前後軸に沿った伸長中に起こる皮膚のパターン形成に関与する細胞および分子イベントの可視化を改善します。上皮が間葉から分離され、2つの成分が再結合されると、新しい相互作用が皮膚のパターンを再確立します。このアプローチにより、間葉系誘導シグナルと、表皮が間葉系シグナルに応答することを可能にする上皮能力分子を評価することができる¹¹。また、羽芽の発達やパターン形成に必要なその後の下流の分子発現も調べることができます。これらの研究により、芽の位置は間葉によって制御されていることが確立されました。間葉と組換える前の上皮90^° の回転は、羽芽の伸びの方向が上皮によって制御されていることを示しています。この方法は、羽芽の向きを制御する分子機構を研究するために不可欠でした¹²。

鳥類の皮膚再構成培養は、皮膚間葉を解離させてから高細胞密度でプレーティングし、無傷の上皮で覆うもので、真皮細胞を原始状態にリセットします。その後、外植片は自己組織化して、前の手がかり¹³から独立した新しい周期パターンを形成する。この皮膚再構成モデルは、羽毛の周期的パターン形成の初期過程を研究するために使用できます。このアプローチを使用して、間葉系細胞と1つの上皮細胞の比率を調節することが、羽芽のサイズまたは数にどのように影響するかを調査しました。芽の数は増加することがわかりましたが、間葉系細胞の比率が増加するにつれて芽のサイズは増加しないことがわかりました。このアプローチのもう一つの利点は、間葉系細胞のウイルス形質導入が他の2つの培養条件よりも高い効率を示し、より明白な表現型を産生できることです。

プロトコル

1. 鶏皮外植片培養(図1)

1. 受精した鶏の卵を加湿インキュベーターで38°Cでインキュベートし、Hamburger and Hamilton¹⁴に従ってステージングします。
   1. ステージ 28 (~E5.5) では、四肢の 2 番目の指と 3 番目の指は他の指よりも長くなります。3本の数字と4本の足の指は区別されます。
   2. ステージ 29 (~E6) では、翼は肘で曲がります。2 桁目は他の桁よりも明らかに長いです。
   3. ステージ30(~E6.5)では、上腕レベルでは脊髄の両側に2列の背側羽芽列が見え、脚の高さでは3列が見られます。
   4. ステージ31(~E7)では、ジャンボ仙骨レベルに~7列の羽があります。
   5. ステージ32では、脚の高さに11列以上の羽芽が存在します。
2. ステージ28-32のニワトリ胚を、ハンクス緩衝生理食塩水(HBSS)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が入った60mmのシャーレに入れます。
   1. 首の下から尾の領域まで胚の背側の皮膚を解剖します。はさみを使って首から頭を取り除きます。手足のつぼみをそっと引っ張って、付属肢を外側に広げて体の腹側を下向きに配置します。
   2. 時計職人の鉗子または鋭利なスプリングハサミを使用して、胚体の両側に沿って皮膚の前方から後方に切開を行います。手足の芽を縦につまむことにより、一対の鉗子で体を安定させるようにしてください。時計職人の鉗子を使用して、首から尾の部分まで、または尾から首にかけて皮膚をやさしく剥がします。
3. 剥がした皮膚に付着したままの皮下組織をやさしく取り除き、鋭利なスプリングハサミで皮膚のエッジをなめらかにします。
4. 10%ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン/ストレプトマイシン溶液(1:100に希釈)を添加したダルベッコの改変イーグルス培地(DMEM)を2 mL/ウェルで6ウェル皿のウェルに加えます。培地と抗生物質を添加したら、培地が培養インサートの外側にくるように、ウェル内に無菌組織培養インサートを置きます。
5. 表皮を上にし、間葉をインサートメンブレン上に向け、へらで皮膚を培養インサートに移します。皮膚がしわなく平らになるように、HBSSのへらに皮膚を引っ張ります。液体で皮膚をへらから滑り込ませて、折りたたむことなく皮膚の移動を容易にします。
6. 200 μLのピペットで培養インサートから余分なHBSSを取り除きます。培養インサートの内側にHBSSの薄層を残して、外植片を半湿らせて気液界面を提供します。
7. 皮膚外植片培養物を37°Cで5%の_CO2 と95%の空気を使用してインキュベートします。2日ごとに媒体を交換してください。
   注:この手順は公開されています⁴。この培養システムは、ウズラやフィンチの皮膚外植片培養などの他の鳥の皮膚にも使用できます。

2. ニワトリの皮上皮-間葉系組換え(図2)

1. 受精した鶏の卵を38°Cの加湿インキュベーターでインキュベートし、Hamburger and Hamilton¹⁴ (セクション1.1)に従って胚をステージングします。
2. 2倍カルシウム-マグネシウムフリー(CMF)生理食塩水と0.25%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)緩衝液を調製します。
   1. 10x CMFバッファー(NaCl(1.37 M)80 g、KCl(0.04 M)3 g、NaH₂PO4(0.004 M)0.5 g、KH₂PO4(2 M)0.25 g、NaHCO₃ (0.12 M)10 g、グルコース(0.1 M)20 gを1,000 mLの蒸留水で調製します。pHを7.3に調整します。0.25% EDTAバッファーを含む2x CMF100 mLを調製するには、まずEDTAを80 mLの蒸留水に溶解し、次に10x CMFバッファー20 mLを添加して、0.25% EDTAワーキング溶液を含む2x CMFを調製する必要があります。
3. 上記のように、ステージ30-32のニワトリ胚背側皮をHBSSで解剖し(セクション1.2)、氷上で0.25%EDTAを含む2x CMF生理食塩水で15-20分間インキュベートします。
4. 時計職人の鉗子を使用して、上皮と間葉を慎重に分離します。分離した上皮と間葉をHBSSを含む清潔な皿に移します。
5. 最初にHBSSを含むシャーレに間葉を配置し、次に上皮を間葉の上に置いて、上皮を間葉と再結合します。上皮を間葉と同じ前後軸に沿って配置するか、上皮を間葉の前後軸から90^° 回転させて、どの成分が皮膚形態形成のさまざまな側面を調節するかを決定します。
6. 再構築した皮膚を6ウェル培養皿の培養インサートに移して成長させ、再構築した皮膚の周りの余分なHBSSを取り除きます。
7. 10% FBSを含む2 mLのDMEM培地をインサートの外側のウェルに入れます。インサートチャンバー内にDMEMの薄層を配置して、外植片を半湿らせて気液界面を提供します。
8. 皮膚組換え体を37°Cで5%_CO2 と95%の空気の混合物中でインキュベートします。2日ごとに媒体を交換してください。解剖顕微鏡に取り付けられたカメラによるタイムラプス撮影を使用して、皮膚発達の初期段階における表現型の変化を記録します。
   注:この手順は公開されています¹¹。

3. 鶏皮の再構成(図3)

1. 受精した鶏の卵を38°Cの加湿インキュベーターでインキュベートし、Hamburger and Hamilton¹⁴ (セクション1.1)に従って胚をステージングします。
2. HBSSでステージ30-33のニワトリ胚の背側の皮を解剖します。上記のように、0.25% EDTAを含む2x CMF生理食塩水でスキンを氷上で15〜20分間インキュベートします(セクション2.3)。
3. 時計職人の鉗子を使用して、上皮と間葉を慎重に分離します。分離した上皮と間葉を氷上のHBSSに移します。
   注:上皮を間葉から分離するときは、上皮の基底層を傷つけないように注意してください。
4. 分離した間葉を15 mLの遠心チューブに集め、PBSで作製した0.1%コラゲナーゼ/トリプシン溶液と37°Cの水浴で10〜15分間インキュベートします。
5. 皮膚間葉をパスツールピペットで解離し、単一細胞懸濁液を作製します。10% FBSを含むDMEMを添加して消化を停止します。
6. 細胞をペレット化し、233 × g で5分間遠心分離します。細胞を2×10⁷ 細胞/mLの濃度の培地で再懸濁しました。
   注:このステップでは、間葉系細胞を遺伝子導入のために氷上で2〜3時間ウイルス含有培地に再懸濁することもできます。
7. 細胞培養インサートを6ウェルディッシュの1ウェルに入れます。2 × 10⁷ 細胞/mL間葉系細胞10 μLを組織培養インサートに滴下します。10% FBSを含む2 mLのDMEM培地をインサートの外側のウェルに置きます。5% CO₂ および95%エアインキュベーターを使用して、めっきした間葉系細胞を37°Cで1時間インキュベートし、細胞がインサートメンブレン上に沈殿するまで待ちます。
8. 1mLピペットを使用して、上皮基底細胞層を間葉系細胞に向け、無傷の上皮をめっきした間葉系液滴の上に移します。
   注:上皮を間葉系液滴に移すとき、間葉系細胞を乱さないでください。
9. 無傷の上皮を間葉の上に平らにして、再構成された皮膚の外植片を作ります。インサート上に培地の薄層を残して、再構成された皮膚外植片を半湿らせて気液界面を提供します。再構成した皮膚外植片を37°Cで5%_CO2 および95%空気インキュベーターでインキュベートします。2日ごとに媒体を交換してください。
   注:この手順は公開されています¹³。

結果

皮膚外植片培養
ex vivo皮膚器官培養物からの羽芽の発達は、顕微鏡下で直接観察できます。ニワトリのステージ30の背側の皮膚の皮膚外植片培養モデルを使用すると、プラコードは正中線に沿って見えます。その後、形態形成前線は徐々に皮膚周辺に向かって横方向に伝播し、新しい羽毛原基が形成されます。これらの羽毛原基は、培養2日後に短い羽芽に成長し、培養4?...

ディスカッション

組織組換えは、上皮と間葉のユニークな寄与を探求するためのアッセイを提供します。ニワトリでは、羽毛は胚の7日目(E7)に発達し始め、鱗はE9から始まります。E9スケール間葉がE7羽毛上皮と再結合されると、再結合された組織は鱗屑を形成し、E7フェザー間葉がE9スケール上皮と再結合されると、羽毛が形成される¹¹。これらの研究は、間葉がパターン形成、間隔、および?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042