Использование эксплантов птичьей кожи для изучения структуры тканей и органогенеза

Резюме

Здесь мы описываем протоколы для трех типов культур эксплантации кожи эмбрионов птиц, которые могут быть использованы для изучения тканевых взаимодействий, 4D-визуализации таймлапс-пленки (3D плюс время), глобальных или локальных возмущений молекулярной функции и характеристик системной биологии.

Аннотация

Развивающаяся птичья кожа во время эмбриогенеза является уникальной моделью, которая может дать ценную информацию о структуре тканей. Здесь описаны три вариации культур эксплантов кожи для изучения различных аспектов развития кожи. Во-первых, культивирование органов ex vivo и манипуляции с ними дают исследователям возможность наблюдать и изучать развитие перьевых почек напрямую. Культура кожных эксплантов может расти в течение 7 дней, что позволяет проводить прямой анализ клеточного поведения и получать 4D-визуализацию с интервалами в течение этого периода роста. Это также позволяет проводить физические и молекулярные манипуляции с условиями культивирования для визуализации реакции тканей. Например, бусины, покрытые фактором роста, могут наноситься локально, чтобы вызвать изменения в рисунке перьев на ограниченной площади. В качестве альтернативы, вирусная трансдукция может быть доставлена глобально в питательных средах для повышения или понижения экспрессии генов. Во-вторых, протокол рекомбинации кожи позволяет исследователям исследовать тканевые взаимодействия между эпидермисом и мезенхимой, которые происходят из разных областей кожи, разных этапов жизни или разных видов. Это дает возможность проверить временное окно, в течение которого эпителий способен реагировать на сигналы, и его способность формировать различные придатки кожи в ответ на сигналы от различных мезенхимальных источников. В-третьих, восстановление кожи с использованием диссоциированных дермальных клеток, покрытых интактным эпителием, обнуляет развитие кожи и позволяет изучить начальные процессы периодического формирования паттернов. Этот подход также расширяет наши возможности по манипулированию экспрессией генов среди диссоциированных клеток перед созданием восстановленного кожного экспланта. В этой статье представлены три протокола культивирования и примеры экспериментов, демонстрирующие их полезность.

Введение

Развитие кожи птичьего эмбриона является отличной моделью для изучения механизмов морфогенеза из-за его особенностей и доступности к микрохирургии и манипуляциям ^1,2. Тем не менее, оценка клеточных и молекулярных событий в интактных тканях может быть затруднена, потому что присутствие посторонних тканей может усложнить микроскопические наблюдения. Кроме того, способность манипулировать экспрессией генов для проверки их роли в морфогенезе кожи не всегда является простой задачей. Мы обнаружили, что можем проверить функции генов с помощью ретровирусной трансдукции с более высоким уровнем успеха на моделях эксплан....

протокол

1. Культура экспланта куриной кожи (рисунок 1)

1. Оплодотворенные куриные яйца инкубируют во влажном инкубаторе при температуре 38 °C и устанавливают их в соответствии с Hamburger и Hamilton¹⁴.
   1. На стадии 28 (~E5.5) второй палец и третий палец конечности длиннее остальных; Три пальца и четыре пальца на ногах различимы.
   2. На стадии 29 (~E6) крыло согнуто в локте; Вторая цифра заметно длиннее остальных.
   3. На стадии 30 (~E6.5) два ряда зачатков спинного пера по обе стороны от спинного мозга видны на уровне плечевой кости, а три ряда видн....

Результаты

Культуры кожных эксплантов
Развитие перьевых почек из культур кожных органов ex vivo можно непосредственно наблюдать под микроскопом. Используя модель культуры экспланта кожи цыплят стадии 30 дорсальной кожи, плакоды видны вдоль средней линии. Затем морфогенетический фро.......

Обсуждение

Рекомбинация тканей обеспечивает анализ для изучения уникального вклада эпителия и мезенхимы. У цыплят перья начинают развиваться на эмбриональный день 7 (Е7), в то время как чешуя начинается на Е9. Когда чешуйчатая мезенхима Е9 рекомбинируется с перьевым эпителием Е7, рекомбинированная .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042