Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем протоколы для трех типов культур эксплантации кожи эмбрионов птиц, которые могут быть использованы для изучения тканевых взаимодействий, 4D-визуализации таймлапс-пленки (3D плюс время), глобальных или локальных возмущений молекулярной функции и характеристик системной биологии.

Аннотация

Развивающаяся птичья кожа во время эмбриогенеза является уникальной моделью, которая может дать ценную информацию о структуре тканей. Здесь описаны три вариации культур эксплантов кожи для изучения различных аспектов развития кожи. Во-первых, культивирование органов ex vivo и манипуляции с ними дают исследователям возможность наблюдать и изучать развитие перьевых почек напрямую. Культура кожных эксплантов может расти в течение 7 дней, что позволяет проводить прямой анализ клеточного поведения и получать 4D-визуализацию с интервалами в течение этого периода роста. Это также позволяет проводить физические и молекулярные манипуляции с условиями культивирования для визуализации реакции тканей. Например, бусины, покрытые фактором роста, могут наноситься локально, чтобы вызвать изменения в рисунке перьев на ограниченной площади. В качестве альтернативы, вирусная трансдукция может быть доставлена глобально в питательных средах для повышения или понижения экспрессии генов. Во-вторых, протокол рекомбинации кожи позволяет исследователям исследовать тканевые взаимодействия между эпидермисом и мезенхимой, которые происходят из разных областей кожи, разных этапов жизни или разных видов. Это дает возможность проверить временное окно, в течение которого эпителий способен реагировать на сигналы, и его способность формировать различные придатки кожи в ответ на сигналы от различных мезенхимальных источников. В-третьих, восстановление кожи с использованием диссоциированных дермальных клеток, покрытых интактным эпителием, обнуляет развитие кожи и позволяет изучить начальные процессы периодического формирования паттернов. Этот подход также расширяет наши возможности по манипулированию экспрессией генов среди диссоциированных клеток перед созданием восстановленного кожного экспланта. В этой статье представлены три протокола культивирования и примеры экспериментов, демонстрирующие их полезность.

Введение

Развитие кожи птичьего эмбриона является отличной моделью для изучения механизмов морфогенеза из-за его особенностей и доступности к микрохирургии и манипуляциям 1,2. Тем не менее, оценка клеточных и молекулярных событий в интактных тканях может быть затруднена, потому что присутствие посторонних тканей может усложнить микроскопические наблюдения. Кроме того, способность манипулировать экспрессией генов для проверки их роли в морфогенезе кожи не всегда является простой задачей. Мы обнаружили, что можем проверить функции генов с помощью ретровирусной трансдукции с более высоким уровнем успеха на моделях эксплан....

протокол

1. Культура экспланта куриной кожи (рисунок 1)

  1. Оплодотворенные куриные яйца инкубируют во влажном инкубаторе при температуре 38 °C и устанавливают их в соответствии с Hamburger и Hamilton14.
    1. На стадии 28 (~E5.5) второй палец и третий палец конечности длиннее остальных; Три пальца и четыре пальца на ногах различимы.
    2. На стадии 29 (~E6) крыло согнуто в локте; Вторая цифра заметно длиннее остальных.
    3. На стадии 30 (~E6.5) два ряда зачатков спинного пера по обе стороны от спинного мозга видны на уровне плечевой кости, а три ряда видн....

Результаты

Культуры кожных эксплантов
Развитие перьевых почек из культур кожных органов ex vivo можно непосредственно наблюдать под микроскопом. Используя модель культуры экспланта кожи цыплят стадии 30 дорсальной кожи, плакоды видны вдоль средней линии. Затем морфогенетический фро.......

Обсуждение

Рекомбинация тканей обеспечивает анализ для изучения уникального вклада эпителия и мезенхимы. У цыплят перья начинают развиваться на эмбриональный день 7 (Е7), в то время как чешуя начинается на Е9. Когда чешуйчатая мезенхима Е9 рекомбинируется с перьевым эпителием Е7, рекомбинированная .......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа поддержана грантами NIH NIAMS R37 AR 060306, R01 AR 047364 и RO1 AR078050. Работа также поддерживается совместным исследовательским контрактом между Университетом Южной Калифорнии и Китайским медицинским университетом на Тайване. Мы благодарим класс USC BISC 480 Developmental Biology 2023 за успешное тестирование этого протокола культивирования птичьей кожи в течение нескольких лабораторных модулей.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6-well culture dish FalconREF 353502Air-Liquid Interface (ALI) Cultures  
Cell culture inset FalconREF 353090.0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1Worthington BiochemicalLS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Corning10-013-CV4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Fetal bovine serumThermoFisher16140-071
GlucoseSigma-AldrichG8270
Hanks’s buffered saline solutionGibco14170-112No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin Gibco15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP5379
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS6014
Sodium chloride (Nacl)EMD CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-AldrichS0751
TrypsinGibco27250-042

Ссылки

  1. Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, (1972).
  2. Sengel, P. . In Morphogenesis of Skin, l-277. , (1976).
  3. Dhouailly, D., Wilehm Roux, .

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

4D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены