إنتاج وتحسين LTE ، وهو نظام تعبير بروتين خال من الخلايا مشتق من الليشمانيا تارينتولاي لإنتاج البروتين المؤتلف

Summary

مستخلص الليشمانيا الانتقالي (LTE) هو نظام تعبير بروتين خال من الخلايا حقيقية النواة مشتق من الطفيلي أحادي الخلية ، Leishmania tarentolae. هذا البروتوكول المحسن يجعل LTE بسيطة وفعالة من حيث التكلفة للتصنيع. وهي مناسبة لمختلف التطبيقات التي تركز على التعبير متعدد التوازي ودراسة البروتينات حقيقية النواة المعقدة وتفاعلاتها.

Abstract

يحدد هذا البروتوكول إنتاج وتحسين نظام التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا حقيقي النواة (CFPS) المشتق من السوط أحادي الخلية Leishmania tarentolae ، والمشار إليه باسم مستخلص الليشمانيا الانتقالي أو LTE. على الرغم من أن هذا الكائن الحي تطور في الأصل كطفيلي من الأبراص ، إلا أنه يمكن زراعته بسهولة وبتكلفة زهيدة في قوارير أو مفاعلات حيوية. على عكس الليشمانيا الكبرى ، فهي غير مسببة للأمراض للإنسان ولا تتطلب احتياطات مخبرية خاصة. ميزة أخرى لاستخدام الليشمانيا ل CFPS هي أن إضافة قليل النوكليوتيد واحد مضاد للحساسية إلى CFPS ، يستهدف تسلسل قائد لصق محفوظ على نهاية 5's لجميع الحمض النووي الريبي المشفر للبروتين ، يمكن أن يثبط تعبير البروتين الداخلي. نحن نقدم إجراءات لتعطيل الخلايا ومعالجة المحللة ، والتي تم تبسيطها وتحسينها مقارنة بالإصدارات السابقة. تبدأ هذه الإجراءات بثقافات قارورة بسيطة. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيفية إدخال المعلومات الجينية باستخدام النواقل التي تحتوي على مواقع بدء الترجمة المستقلة عن الأنواع (SITS) وكيفية إجراء تحسين مباشر للدفعات ومراقبة الجودة لضمان جودة تعبير البروتين المتسقة.

Introduction

في ستينيات القرن العشرين ، لعبت أنظمة التعبير عن البروتين الخالية من الخلايا دورا محوريا في الكشف عن الشفرة الوراثية¹. ومع ذلك ، فإن أنظمة التعبير عن البروتين الخالية من الخلايا بدائية النواة ، والتي تعتمد بشكل أساسي على الإشريكية القولونية ، تهيمن حاليا على كل من التطبيقات المختبرية والتجارية. في حين أن الأنظمة القائمة على الإشريكية القولونية توفر مزايا مثل الفعالية من حيث التكلفة وقابلية التوسع وإنتاجية التعبير العالية ، فإنها تواجه تحديات عند إنتاج بروتينات متعددة المجالات في أشكالها النشطة وتسهيل تجميع مجمعات البروتين ^2,3. في الوقت....

Protocol

يتضمن هذا البروتوكول وصفات وخطوات وسائط مفصلة تتضمن الزراعة ، والطرد المركزي ، وقياس مضان GFP باستخدام قارئ صفائح متعدد الأوضاع ، وقياس ثقافة OD_600nm ، وتقييم تحلل Abs_280nm. كما يغطي إعداد وتصوير المواد الهلامية البروتينية SDS-PAGE. يتم سرد المواد المطلوبة أو المقترحة لهذا البروتوكول في جدول بيانات المواد. من المهم ملاحظة أنه من المحتمل استخدام موارد المختبر النموذجية مثل مكونات الوسائط وأجهزة الطرد المركزي والأنابيب ومقاييس الطيف الضوئي وإعدادات الرحلان الكهربائي الهلامي بالتبادل ما لم ينص على خلاف ذلك. يقدم الشكل 1 ملخصا لعملية تصنيع LTE.

النتائج

الغرض من التعبير البروتيني الخالي من الخلايا هو إنتاج بروتينات كاملة الطول في شكل نشط مطوي مناسب لمجموعة واسعة من التطبيقات. تمت مقارنة LTE (مستخلص الليشمانيا تارينتولا ) سابقا بأنظمة التعبير الخالية من الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة ، مما يدل على قدرة عالية ع?.......

Discussion

تم نشر بروتوكولات إنشاء LTE على مدار العقد الماضي⁷ وخضعت لتحديثات دورية^25,34. ومع ذلك ، غالبا ما يواجه الوافدون الجدد إلى هذه التقنية منحنى تعليمي حاد ، مما يؤدي إلى تأخير في تحقيق تعبير بروتين عالي الجودة وعالي الغلة. تم الإبلاغ ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PD-10 SuperDex 25 Columns	Cytiva	17085101	Gel filtration columns
Nitrogen Cavitation cell disrupter	Parr Industries	4635 or 4639	Cell Disrupter
Bovine derived Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Culture additive
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Antibiotic mix
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Multiwell plate for 10ul expressions
Oligonucleotide	IDT synthesis		Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzyme
Tecan Spark	Tecan		or similar Multimode Platereader
Chemidoc MP Imager	Biorad		or similar SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biophotometer	Eppendorf		or similar Cuvette Specrophotometer
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop spectrophotometer
Avanti JXN-26 centrifuge	Beckman Coulter		or similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g
5424R microcentrifuge	Eppendorf		or similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes
Flask Incubator Inova S44i	Eppendorf		or similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks
5L glass culture flasks			Baffled glass flasks for culture growth
Bactotryptone	BD	211705	Growth medium
Yeast Extract	Merck	VM930053	Growth medium
Glycerol			Any analytical grade
Glucose			Any analytical grade
KH2PO4			Any analytical grade
K2HPO4			Any analytical grade
UltraPure water	Invitrogen	10977-015	Or output from any MilliQ-type water dispenser