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利什曼原虫翻译提取物 (LTE) 是一种源自单细胞寄生虫利 什曼原虫的真核无细胞蛋白表达系统。这种优化的协议使 LTE 的制造变得简单且具有成本效益。它适用于专注于复杂真核蛋白及其相互作用的多平行表达和研究的各种应用。
该方案概述了源自单细胞鞭毛利 什曼原虫 tarentolae 的真核无细胞蛋白表达系统 (CFPS) 的生产和优化,称为利什曼原虫翻译提取物或 LTE。虽然这种生物最初是作为壁虎的寄生虫进化而来的,但它可以在烧瓶或生物反应器中轻松且廉价地培养。与 重型利什曼原虫不同,它对人类无致病性,不需要特殊的实验室预防措施。将利什曼原虫用于 CFPS 的另一个优点是,向 CFPS 中添加单个反义寡核苷酸,靶向所有蛋白质编码 RNA 的 5' 端的保守剪接前导序列,可以抑制内源性蛋白质表达。我们提供细胞破碎和裂解物处理的程序,与以前的版本相比,这些程序已得到简化和改进。这些程序从简单的培养瓶培养开始。此外,我们还解释了如何使用包含物种非依赖性翻译起始位点 (SITS) 的载体引入遗传信息,以及如何进行简单的批次优化和质量控制以确保一致的蛋白质表达质量。
在 1960 年代,无细胞蛋白表达系统在揭示遗传密码方面发挥了关键作用1。然而,主要基于大肠杆菌的原核无细胞蛋白表达系统目前在实验室和商业应用中占主导地位。虽然基于大肠杆菌的系统具有成本效益、可扩展性和高表达产量等优势,但它们在生产活性形式的多结构域蛋白和促进蛋白质复合物的组装时面临挑战 2,3。如今,真核生物无细胞蛋白合成 (CFPS) 的常用形式包括小麦胚芽提取物 (WGE)、兔网织红细胞裂解物 (RRL) 和昆虫细胞裂解物 (ICL)4,5,6。这项工作介绍了一种基于单细胞鞭毛寄生虫 Leishmania tarentolae 的替代真核无细胞系统,该系统既简单又可扩展。
利什曼原虫 可以使用经济高效的培养基在培养瓶中轻松培养,也可以在生物反应器中扩大规模以实现更高的细胞密度。细胞裂解物中存在的内源性 mRNA(否则可能会与引入的信息竞争)可以使用靶向保守利什曼原虫 mRNA 剪接前导序列的反义寡核苷酸7 进行中和。与导致人类疾病的大 利什曼原虫不同, L. tarentolae 会感染沼泽壁虎 (Tarentolae mauritanica),使其适合在 PC2 实验室环境中培养,无需特殊预防措施。它以前曾被用作体内蛋白表达的转基因生物8。
为了促进无细胞系统中的模板引发,基于聚合物 RNA 结构设计了通用序列,以增强翻译起始9。这些不依赖物种的翻译序列 (SITS) 适用于原核和真核无细胞系统,并且适合将遗传信息引入 LTE。虽然该方案没有提供 LTE 无细胞蛋白表达载体构建的详细解释,但优化和质量控制需要合适的载体,其中包含 SITS 位点下游所需目标蛋白质的荧光团融合。为此,已将适当的 LTE 载体存放在 Addgene 基因存储库中,例如 pCellFree_G03 载体,它使用 Gateway 克隆位点编码 N 端 eGFP 融合到所需的目标蛋白质。
LTE 已在需要蛋白质表达的广泛应用中证明了其价值,包括蛋白质自组装分析 10,16、人整合膜蛋白的生产17、抗病毒候选药物的研究18、生物技术有用的酶的开发19、蛋白质生物传感器的原型设计20,21 以及钩虫生物制剂的研究22.LTE 还有助于绘制病毒学和细胞结构领域的蛋白质-蛋白质相互作用网络21,32。LTE 的基准性能与其他真核无细胞系统相似,可表达全长、单分散和非聚集蛋白33,同时提供更具成本效益和可扩展性的生产。
该方案提供了培养和破坏宿主生物体、制备裂解物和补充用于偶联转录/翻译蛋白表达的补料溶液 (FS) 的技术。此外,它还包括用于优化生产批次的协议。在利什曼原虫无细胞系统的初始版本中,在表达水平、全长蛋白质的分数和蛋白质聚集体的存在方面观察到不希望的批次间变化,导致批次34 的处理。随后对协议进行了改进以解决此问题25。当前的方案建立在这些改进的基础上,允许针对单个批次的峰值蛋白质表达和大小进行优化。它通过密切控制细胞破坏物负载(以 600 nm 处的光密度测量;OD600 nm),并使用 280 nm 处的吸光度 (Abs280 nm) 对所得裂解物输出进行归一化。此外,它还结合了一种在制造过程中用 rNTP 和镁部分补充裂解物的方法,随后在测试表达期间优化这些补料溶液组分。尽管此优化在协议中作为一个选项提供,但作者强烈建议这样做。
该方案包括详细的培养基配方和步骤,包括培养、离心、使用多功能酶标仪测量 GFP 荧光、测量培养物 OD600 nm 和评估裂解物 Abs280 nm。它还涵盖了 SDS-PAGE 蛋白凝胶的设置和成像。该实验方案所需或建议的材料列在材料电子表格中。需要注意的是,除非另有说明,否则典型的实验室资源(如培养基组件、离心机、试管、分光光度计和凝胶电泳装置)可以互换使用。 图 1 提供了 LTE 制造过程的摘要。
图 1:LTE 制造协议概述。 此漫画简要概述了 LTE 制造协议。 请单击此处查看此图的较大版本。
1. 利什曼原虫培养物的生长
2. L. tarentolae 培养物的浓度
3. L. tarentolae 浓缩物的裂解
4. 细胞裂解物的离心
5. 细胞裂解物的凝胶过滤
注:凝胶过滤用于去除 SEB 缓冲液中包含的蔗糖。虽然蔗糖有助于在细胞破碎过程中稳定细胞机制,但如果保留在蛋白质表达反应中,则会降低产量。
6. 补充细胞裂解物
7. 最终补充 LTE 的 QC 和优化
注:确定向还原的 rNTP 和补充镁的裂解物中适当“补充”添加 rNTP.Mg 的最少必要步骤包括在没有融合伴侣的情况下表达 eGFP 或类似的荧光团(例如,sfGFP)。向反应中加入浓度递增的 rNTP.Mg 以确定表达水平( 通过 多功能酶板机以 eGFP RFU 测量)优化的点。eGFP 的过早终止(不发出荧光)在过高的 eGFP rNTP.Mg 浓度下降低会变得明显。然而,LTE 的短产物功能障碍在较大表达的蛋白 (>50 kDa) 中更频繁地发生。因此,可以使用比 eGFP 更大的模板来执行此优化,特别是如果模板可用于合适的表达载体,从而提供 LTE 为特定应用或研究所需的荧光团融合(参见代表性结果部分)。
无细胞蛋白表达的目的是以折叠的活性形式产生全长蛋白,适用于广泛的应用。LTE(利什曼原虫 提取物)之前已与其他原核和真核无细胞表达系统进行了比较,在最佳操作时表现出避免截断和聚集的高能力,特别是与基于 大肠杆菌的无细胞表达相比33。然而,这在以前伴随着输出质量的显著批次间差异。当前方法进行了进一步改进,以确?...
用于创建 LTE 的协议在过去十年中已经发布7 ,并经历了定期更新25,34。然而,该技术的新手经常会遇到陡峭的学习曲线,导致延迟实现高质量和高产量的蛋白质表达。其他研究小组也报告了类似的挑战 LTE35,特别是关于显著的批次间变化。基于视频的协议格式可能会提供额外的、不太明显的?...
不存在相互竞争的经济利益。
作者要感谢在过去 10 年中为 LTE 系统开发做出贡献的许多 Alexandrov 实验室成员,特别是开创该系统并开发 SITS 核糖体进入位点的 Sergey Mureev。 图 1 由 Biorender.com 创建,经许可复制。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PD-10 SuperDex 25 Columns | Cytiva | 17085101 | Gel filtration columns |
Nitrogen Cavitation cell disrupter | Parr Industries | 4635 or 4639 | Cell Disrupter |
Bovine derived Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | Culture additive |
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml | Thermo-Fisher | 15140122 | Antibiotic mix |
Optiplate 384 | Perkin-Elmer | 6007290 | Multiwell plate for 10ul expressions |
Oligonucleotide | IDT synthesis | Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT | |
Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | 9001-15-4 | Enzyme |
Tecan Spark | Tecan | or similar Multimode Platereader | |
Chemidoc MP Imager | Biorad | or similar SDS-PAGE gel Imager | |
4-12% Bis-Tris Gels | Invitrogen | NW04125 | SDS-PAGE gels |
Biophotometer | Eppendorf | or similar Cuvette Specrophotometer | |
Nanodrop One | Thermofisher | Nanodrop spectrophotometer | |
Avanti JXN-26 centrifuge | Beckman Coulter | or similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g | |
5424R microcentrifuge | Eppendorf | or similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes | |
Flask Incubator Inova S44i | Eppendorf | or similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks | |
5L glass culture flasks | Baffled glass flasks for culture growth | ||
Bactotryptone | BD | 211705 | Growth medium |
Yeast Extract | Merck | VM930053 | Growth medium |
Glycerol | Any analytical grade | ||
Glucose | Any analytical grade | ||
KH2PO4 | Any analytical grade | ||
K2HPO4 | Any analytical grade | ||
UltraPure water | Invitrogen | 10977-015 | Or output from any MilliQ-type water dispenser |
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