リーシュマニアタレントラエ由来の無細胞タンパク質発現システムであるLTEの作製と最適化

要約

Leishmania Translational Extract(LTE)は、単細胞寄生虫である Leishmania tarentolaeに由来する真核生物の無細胞タンパク質発現系です。この最適化されたプロトコルにより、LTEは製造が簡単で費用対効果に優れています。これは、複雑な真核生物タンパク質とその相互作用のマルチパラレル発現と研究に焦点を当てたさまざまなアプリケーションに適しています。

要約

このプロトコルでは、Leishmania Translational ExtractまたはLTEと呼ばれる単細胞鞭毛 Leishmania tarentolaeに由来する真核生物の無細胞タンパク質発現システム(CFPS)の作製と最適化について概説しています。この生物はもともとヤモリの寄生虫として進化しましたが、フラスコやバイオリアクターで簡単かつ安価に培養できます。 リーシュマニアメジャーとは異なり、ヒトに対して非病原性であり、特別な実験室での予防措置は必要ありません。CFPSにリーシュマニアを使用するもう一つの利点は、すべてのタンパク質コードRNAの5'末端に保存されたスプライスリーダー配列を標的とする単一のアンチセンスオリゴヌクレオチドをCFPSに追加することで、内因性タンパク質の発現を抑制できることです。細胞破壊とライセート処理の手順を提供しており、以前のバージョンと比較して簡素化および改善されています。これらの手順は、単純なフラスコ培養から始まります。さらに、種に依存しない翻訳開始部位(SITS)を含むベクターを使用して遺伝情報を導入する方法や、一貫したタンパク質発現品質を確保するための簡単なバッチ最適化と品質管理を行う方法についても説明します。

概要

1960年代には、無細胞タンパク質発現系が遺伝暗号¹の解明に重要な役割を果たしました。しかし、主に大腸菌に基づく原核生物の無細胞タンパク質発現系は、現在、実験室および商業アプリケーションの両方を支配しています。大腸菌ベースのシステムは、費用対効果、スケーラビリティ、高発現収率などの利点を提供する一方で、活性型のマルチドメインタンパク質を産生し、タンパク質複合体の組み立てを容易にする際に課題に直面します^2,3。現在、真核生物の無細胞タンパク質合成(CFPS)の一般的に使用される形態には、小麦胚芽抽出物(WGE)、ウサギ網状赤血球溶解物(RRL)、および昆虫細胞溶解物(ICL)^4,5,6が含まれます。この研究では、単細胞の鞭毛虫であるLeishmania tarentolaeに基づく、簡単でスケーラブルな代替の真核生物無細胞システムを紹介します。

リーシュマニアタレントラエ は、費用対効果の高い....

プロトコル

このプロトコールには、培養、遠心分離、マルチモードプレートリーダーを使用したGFP蛍光の測定、培養OD_600nmの測定、ライセートAbs_280nmの評価を含む詳細な培地レシピとステップが含まれています。また、SDS-PAGEタンパク質ゲルのセットアップとイメージングについても説明します。このプロトコールに必要な材料または推奨される材料は、材料スプレッドシートに記載されています。メディアコンポーネント、遠心分離機、チューブ、分光光度計、ゲル電気泳動セットアップなどの一般的なラボリソースは、特に指定がない限り、同じ意味で使用できる可能性が高いことに注意することが重要です。 図 1 に、LTE 製造プロセスの概要を示します。

図1:LTE製造プロトコルの概要。 この漫画は、LTE 製造プロトコ....

ディスカッション

LTEを作成するためのプロトコルは、過去10年間で公開されており^{7、定期的な}更新を受けています^25,34。しかし、この技術を初めて使用すると、学習曲線が急になることが多く、その結果、高品質で高収率のタンパク質発現を達成するのが遅れます。LTE³⁵を扱う他の研究グループでも同様の.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PD-10 SuperDex 25 Columns	Cytiva	17085101	Gel filtration columns
Nitrogen Cavitation cell disrupter	Parr Industries	4635 or 4639	Cell Disrupter
Bovine derived Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Culture additive
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Antibiotic mix
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Multiwell plate for 10ul expressions
Oligonucleotide	IDT synthesis		Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzyme
Tecan Spark	Tecan		or similar Multimode Platereader
Chemidoc MP Imager	Biorad		or similar SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biophotometer	Eppendorf		or similar Cuvette Specrophotometer
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop spectrophotometer
Avanti JXN-26 centrifuge	Beckman Coulter		or similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g
5424R microcentrifuge	Eppendorf		or similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes
Flask Incubator Inova S44i	Eppendorf		or similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks
5L glass culture flasks			Baffled glass flasks for culture growth
Bactotryptone	BD	211705	Growth medium
Yeast Extract	Merck	VM930053	Growth medium
Glycerol			Any analytical grade
Glucose			Any analytical grade
KH2PO4			Any analytical grade
K2HPO4			Any analytical grade
UltraPure water	Invitrogen	10977-015	Or output from any MilliQ-type water dispenser