A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
תמצית לישמניה תרגומית (LTE) היא מערכת ביטוי חלבונים אאוקריוטית נטולת תאים שמקורה בטפיל חד-תאי, Leishmania tarentolae. פרוטוקול ממוטב זה הופך את LTE לפשוט וחסכוני לייצור. הוא מתאים ליישומים שונים המתמקדים בביטוי רב-מקבילי ולימוד של חלבונים איקריוטים מורכבים והאינטראקציות ביניהם.
פרוטוקול זה מתאר את הייצור והאופטימיזציה של מערכת ביטוי חלבון ללא תאים אאוקריוטית (CFPS) שמקורה בשוטונים חד-תאיים Leishmania tarentolae, המכונה תמצית תרגום לישמניה או LTE. למרות שאורגניזם זה התפתח במקור כטפיל של שממיות, ניתן לטפח אותו בקלות ובזול בצלוחיות או ביוריאקטורים. שלא כמו לישמניה מז'ור, היא אינה פתוגנית לבני אדם ואינה דורשת אמצעי מעבדה מיוחדים. יתרון נוסף של השימוש בלישמניה עבור CFPS הוא שהוספת אוליגונוקלאוטיד אנטיסנס יחיד ל-CFPS, המכוון לרצף מוביל שחבור שמור בקצה 5' של כל הרנ"א המקודד חלבון, יכולה לדכא ביטוי חלבונים אנדוגניים. אנו מספקים נהלים לשיבוש תאים ועיבוד ליזט, אשר פושטו ושופרו בהשוואה לגרסאות קודמות. הליכים אלה מתחילים בתרביות בקבוקים פשוטות. בנוסף, אנו מסבירים כיצד להציג מידע גנטי באמצעות וקטורים המכילים אתרי ייזום תרגום שאינם תלויים במינים (SITS) וכיצד לבצע אופטימיזציה פשוטה של אצווה ובקרת איכות כדי להבטיח איכות ביטוי חלבון עקבית.
בשנות ה-60 של המאה ה-20, מערכות ביטוי חלבונים ללא תאים מילאו תפקיד מרכזי בחשיפת הקוד הגנטי1. עם זאת, מערכות ביטוי חלבונים נטולי תאים פרוקריוטים, המבוססות בעיקר על E. coli, שולטות כיום הן ביישומים מעבדתיים והן ביישומים מסחריים. בעוד שמערכות מבוססות E. coli מציעות יתרונות כגון עלות-תועלת, מדרגיות ותשואות ביטוי גבוהות, הן מתמודדות עם אתגרים בעת ייצור חלבונים רב-תחומיים בצורתם הפעילה ומקלות על הרכבת קומפלקסים חלבוניים 2,3. כיום, צורות נפוצות של סינתזת חלבונים ללא תאים אאוקריוטים (CFPS) כוללות תמצית נבט חיטה (WGE), ארנב רטיקולוציטים ליזט (R....
פרוטוקול זה כולל מתכוני מדיה מפורטים ושלבים הכוללים תרבית, צנטריפוגה, מדידת פלואורסצנטיות GFP באמצעות קורא לוחות רב-מצבים, מדידת תרבית OD600nm והערכת ליזט Abs280nm. הוא מכסה גם את ההתקנה וההדמיה של ג'ל חלבון SDS-PAGE. החומרים הדרושים או המוצעים עבור פרוטוקול זה מפורטים בגיליון האלקטרוני של חומרים. חשוב לציין כי משאבי מעבדה טיפוסיים כגון רכיבי מדיה, צנטריפוגות, צינורות, ספקטרופוטומטרים ומערכי אלקטרופורזה בג'ל עשויים לשמש לסירוגין, אלא אם כן צוין אחרת. איור 1 מספק סיכום של תהליך הייצור של LTE.
מטרת ביטוי חלבונים ללא תאים היא לייצר חלבונים באורך מלא בצורה מקופלת ופעילה המתאימה למגוון רחב של יישומים. LTE (תמצית Leishmania tarentolae ) הושוותה בעבר למערכות ביטוי פרוקריוטיות ואיקריוטיות אחרות ללא תאים, והדגימה יכולת גבוהה להימנע מחיתוך וצבירה כאשר הן פועלות בצורה אופטי.......
פרוטוקולים ליצירת LTE פורסמו בעשור האחרון7 ועברו עדכונים תקופתיים25,34. עם זאת, מצטרפים חדשים לטכניקה נתקלים לעתים קרובות בעקומת למידה תלולה, וכתוצאה מכך עיכובים בהשגת ביטוי חלבון באיכות גבוהה ותשואה גבוהה. אתגרים דומים דווחו ע?.......
אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
המחברים מבקשים להודות לחברי מעבדת אלכסנדרוב הרבים שתרמו לפיתוח מערכות LTE במהלך 10 השנים האחרונות, ובמיוחד לסרגיי מורייב שהיה חלוץ המערכת ופיתח את אתר הכניסה לריבוזום SITS. איור 1 נוצר על-ידי Biorender.com ושוכפל ברישיון.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
PD-10 SuperDex 25 Columns | Cytiva | 17085101 | Gel filtration columns |
Nitrogen Cavitation cell disrupter | Parr Industries | 4635 or 4639 | Cell Disrupter |
Bovine derived Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | Culture additive |
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml | Thermo-Fisher | 15140122 | Antibiotic mix |
Optiplate 384 | Perkin-Elmer | 6007290 | Multiwell plate for 10ul expressions |
Oligonucleotide | IDT synthesis | Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT | |
Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | 9001-15-4 | Enzyme |
Tecan Spark | Tecan | or similar Multimode Platereader | |
Chemidoc MP Imager | Biorad | or similar SDS-PAGE gel Imager | |
4-12% Bis-Tris Gels | Invitrogen | NW04125 | SDS-PAGE gels |
Biophotometer | Eppendorf | or similar Cuvette Specrophotometer | |
Nanodrop One | Thermofisher | Nanodrop spectrophotometer | |
Avanti JXN-26 centrifuge | Beckman Coulter | or similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g | |
5424R microcentrifuge | Eppendorf | or similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes | |
Flask Incubator Inova S44i | Eppendorf | or similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks | |
5L glass culture flasks | Baffled glass flasks for culture growth | ||
Bactotryptone | BD | 211705 | Growth medium |
Yeast Extract | Merck | VM930053 | Growth medium |
Glycerol | Any analytical grade | ||
Glucose | Any analytical grade | ||
KH2PO4 | Any analytical grade | ||
K2HPO4 | Any analytical grade | ||
UltraPure water | Invitrogen | 10977-015 | Or output from any MilliQ-type water dispenser |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved