A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תמצית לישמניה תרגומית (LTE) היא מערכת ביטוי חלבונים אאוקריוטית נטולת תאים שמקורה בטפיל חד-תאי, Leishmania tarentolae. פרוטוקול ממוטב זה הופך את LTE לפשוט וחסכוני לייצור. הוא מתאים ליישומים שונים המתמקדים בביטוי רב-מקבילי ולימוד של חלבונים איקריוטים מורכבים והאינטראקציות ביניהם.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את הייצור והאופטימיזציה של מערכת ביטוי חלבון ללא תאים אאוקריוטית (CFPS) שמקורה בשוטונים חד-תאיים Leishmania tarentolae, המכונה תמצית תרגום לישמניה או LTE. למרות שאורגניזם זה התפתח במקור כטפיל של שממיות, ניתן לטפח אותו בקלות ובזול בצלוחיות או ביוריאקטורים. שלא כמו לישמניה מז'ור, היא אינה פתוגנית לבני אדם ואינה דורשת אמצעי מעבדה מיוחדים. יתרון נוסף של השימוש בלישמניה עבור CFPS הוא שהוספת אוליגונוקלאוטיד אנטיסנס יחיד ל-CFPS, המכוון לרצף מוביל שחבור שמור בקצה 5' של כל הרנ"א המקודד חלבון, יכולה לדכא ביטוי חלבונים אנדוגניים. אנו מספקים נהלים לשיבוש תאים ועיבוד ליזט, אשר פושטו ושופרו בהשוואה לגרסאות קודמות. הליכים אלה מתחילים בתרביות בקבוקים פשוטות. בנוסף, אנו מסבירים כיצד להציג מידע גנטי באמצעות וקטורים המכילים אתרי ייזום תרגום שאינם תלויים במינים (SITS) וכיצד לבצע אופטימיזציה פשוטה של אצווה ובקרת איכות כדי להבטיח איכות ביטוי חלבון עקבית.

Introduction

בשנות ה-60 של המאה ה-20, מערכות ביטוי חלבונים ללא תאים מילאו תפקיד מרכזי בחשיפת הקוד הגנטי1. עם זאת, מערכות ביטוי חלבונים נטולי תאים פרוקריוטים, המבוססות בעיקר על E. coli, שולטות כיום הן ביישומים מעבדתיים והן ביישומים מסחריים. בעוד שמערכות מבוססות E. coli מציעות יתרונות כגון עלות-תועלת, מדרגיות ותשואות ביטוי גבוהות, הן מתמודדות עם אתגרים בעת ייצור חלבונים רב-תחומיים בצורתם הפעילה ומקלות על הרכבת קומפלקסים חלבוניים 2,3. כיום, צורות נפוצות של סינתזת חלבונים ללא תאים אאוקריוטים (CFPS) כוללות תמצית נבט חיטה (WGE), ארנב רטיקולוציטים ליזט (R....

Protocol

פרוטוקול זה כולל מתכוני מדיה מפורטים ושלבים הכוללים תרבית, צנטריפוגה, מדידת פלואורסצנטיות GFP באמצעות קורא לוחות רב-מצבים, מדידת תרבית OD600nm והערכת ליזט Abs280nm. הוא מכסה גם את ההתקנה וההדמיה של ג'ל חלבון SDS-PAGE. החומרים הדרושים או המוצעים עבור פרוטוקול זה מפורטים בגיליון האלקטרוני של חומרים. חשוב לציין כי משאבי מעבדה טיפוסיים כגון רכיבי מדיה, צנטריפוגות, צינורות, ספקטרופוטומטרים ומערכי אלקטרופורזה בג'ל עשויים לשמש לסירוגין, אלא אם כן צוין אחרת. איור 1 מספק סיכום של תהליך הייצור של LTE.

תוצאות

מטרת ביטוי חלבונים ללא תאים היא לייצר חלבונים באורך מלא בצורה מקופלת ופעילה המתאימה למגוון רחב של יישומים. LTE (תמצית Leishmania tarentolae ) הושוותה בעבר למערכות ביטוי פרוקריוטיות ואיקריוטיות אחרות ללא תאים, והדגימה יכולת גבוהה להימנע מחיתוך וצבירה כאשר הן פועלות בצורה אופטי.......

Discussion

פרוטוקולים ליצירת LTE פורסמו בעשור האחרון7 ועברו עדכונים תקופתיים25,34. עם זאת, מצטרפים חדשים לטכניקה נתקלים לעתים קרובות בעקומת למידה תלולה, וכתוצאה מכך עיכובים בהשגת ביטוי חלבון באיכות גבוהה ותשואה גבוהה. אתגרים דומים דווחו ע?.......

Disclosures

אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לחברי מעבדת אלכסנדרוב הרבים שתרמו לפיתוח מערכות LTE במהלך 10 השנים האחרונות, ובמיוחד לסרגיי מורייב שהיה חלוץ המערכת ופיתח את אתר הכניסה לריבוזום SITS. איור 1 נוצר על-ידי Biorender.com ושוכפל ברישיון.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PD-10 SuperDex 25 ColumnsCytiva17085101Gel filtration columns
Nitrogen Cavitation cell disrupterParr Industries4635 or 4639Cell Disrupter
Bovine derived HeminSigma-AldrichH5533Culture additive
Penicillin/Streptomycin 10000U/mlThermo-Fisher15140122Antibiotic mix
Optiplate 384Perkin-Elmer6007290Multiwell plate for 10ul expressions
OligonucleotideIDT synthesis Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC
TTATATAGCGTT
Creatine PhosphokinaseSigma-Aldrich9001-15-4Enzyme
Tecan SparkTecanor similar Multimode Platereader
Chemidoc MP ImagerBiorador similar SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris GelsInvitrogenNW04125SDS-PAGE gels
BiophotometerEppendorfor similar Cuvette Specrophotometer
Nanodrop OneThermofisherNanodrop spectrophotometer
Avanti JXN-26 centrifugeBeckman Coulteror similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g
5424R microcentrifugeEppendorfor similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes
Flask Incubator Inova S44iEppendorfor similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks
5L glass culture flasksBaffled glass flasks for culture growth
BactotryptoneBD211705Growth medium
Yeast ExtractMerckVM930053Growth medium
GlycerolAny analytical grade
GlucoseAny analytical grade
KH2PO4Any analytical grade
K2HPO4Any analytical grade
UltraPure waterInvitrogen10977-015Or output from any MilliQ-type water dispenser

References

  1. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E.coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA. 47 (10), 1588-1602 (1961).
  2. Caschera, F., Noireaux, V.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved