ייצור ואופטימיזציה של LTE, מערכת ביטוי חלבונים ללא תאים המופקת מלישמניה טרנטולאי לייצור חלבונים רקומביננטיים

Summary

תמצית לישמניה תרגומית (LTE) היא מערכת ביטוי חלבונים אאוקריוטית נטולת תאים שמקורה בטפיל חד-תאי, Leishmania tarentolae. פרוטוקול ממוטב זה הופך את LTE לפשוט וחסכוני לייצור. הוא מתאים ליישומים שונים המתמקדים בביטוי רב-מקבילי ולימוד של חלבונים איקריוטים מורכבים והאינטראקציות ביניהם.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את הייצור והאופטימיזציה של מערכת ביטוי חלבון ללא תאים אאוקריוטית (CFPS) שמקורה בשוטונים חד-תאיים Leishmania tarentolae, המכונה תמצית תרגום לישמניה או LTE. למרות שאורגניזם זה התפתח במקור כטפיל של שממיות, ניתן לטפח אותו בקלות ובזול בצלוחיות או ביוריאקטורים. שלא כמו לישמניה מז'ור, היא אינה פתוגנית לבני אדם ואינה דורשת אמצעי מעבדה מיוחדים. יתרון נוסף של השימוש בלישמניה עבור CFPS הוא שהוספת אוליגונוקלאוטיד אנטיסנס יחיד ל-CFPS, המכוון לרצף מוביל שחבור שמור בקצה 5' של כל הרנ"א המקודד חלבון, יכולה לדכא ביטוי חלבונים אנדוגניים. אנו מספקים נהלים לשיבוש תאים ועיבוד ליזט, אשר פושטו ושופרו בהשוואה לגרסאות קודמות. הליכים אלה מתחילים בתרביות בקבוקים פשוטות. בנוסף, אנו מסבירים כיצד להציג מידע גנטי באמצעות וקטורים המכילים אתרי ייזום תרגום שאינם תלויים במינים (SITS) וכיצד לבצע אופטימיזציה פשוטה של אצווה ובקרת איכות כדי להבטיח איכות ביטוי חלבון עקבית.

Introduction

בשנות ה-60 של המאה ה-20, מערכות ביטוי חלבונים ללא תאים מילאו תפקיד מרכזי בחשיפת הקוד הגנטי¹. עם זאת, מערכות ביטוי חלבונים נטולי תאים פרוקריוטים, המבוססות בעיקר על E. coli, שולטות כיום הן ביישומים מעבדתיים והן ביישומים מסחריים. בעוד שמערכות מבוססות E. coli מציעות יתרונות כגון עלות-תועלת, מדרגיות ותשואות ביטוי גבוהות, הן מתמודדות עם אתגרים בעת ייצור חלבונים רב-תחומיים בצורתם הפעילה ומקלות על הרכבת קומפלקסים חלבוניים ^2,3. כיום, צורות נפוצות של סינתזת חלבונים ללא תאים אאוקריוטים (CFPS) כוללות תמצית נבט חיטה (WGE), ארנב רטיקולוציטים ליזט (R....

Protocol

פרוטוקול זה כולל מתכוני מדיה מפורטים ושלבים הכוללים תרבית, צנטריפוגה, מדידת פלואורסצנטיות GFP באמצעות קורא לוחות רב-מצבים, מדידת תרבית OD_600nm והערכת ליזט Abs_280nm. הוא מכסה גם את ההתקנה וההדמיה של ג'ל חלבון SDS-PAGE. החומרים הדרושים או המוצעים עבור פרוטוקול זה מפורטים בגיליון האלקטרוני של חומרים. חשוב לציין כי משאבי מעבדה טיפוסיים כגון רכיבי מדיה, צנטריפוגות, צינורות, ספקטרופוטומטרים ומערכי אלקטרופורזה בג'ל עשויים לשמש לסירוגין, אלא אם כן צוין אחרת. איור 1 מספק סיכום של תהליך הייצור של LTE.

תוצאות

מטרת ביטוי חלבונים ללא תאים היא לייצר חלבונים באורך מלא בצורה מקופלת ופעילה המתאימה למגוון רחב של יישומים. LTE (תמצית Leishmania tarentolae ) הושוותה בעבר למערכות ביטוי פרוקריוטיות ואיקריוטיות אחרות ללא תאים, והדגימה יכולת גבוהה להימנע מחיתוך וצבירה כאשר הן פועלות בצורה אופטי.......

Discussion

פרוטוקולים ליצירת LTE פורסמו בעשור האחרון⁷ ועברו עדכונים תקופתיים^25,34. עם זאת, מצטרפים חדשים לטכניקה נתקלים לעתים קרובות בעקומת למידה תלולה, וכתוצאה מכך עיכובים בהשגת ביטוי חלבון באיכות גבוהה ותשואה גבוהה. אתגרים דומים דווחו ע?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PD-10 SuperDex 25 Columns	Cytiva	17085101	Gel filtration columns
Nitrogen Cavitation cell disrupter	Parr Industries	4635 or 4639	Cell Disrupter
Bovine derived Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Culture additive
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Antibiotic mix
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Multiwell plate for 10ul expressions
Oligonucleotide	IDT synthesis		Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzyme
Tecan Spark	Tecan		or similar Multimode Platereader
Chemidoc MP Imager	Biorad		or similar SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biophotometer	Eppendorf		or similar Cuvette Specrophotometer
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop spectrophotometer
Avanti JXN-26 centrifuge	Beckman Coulter		or similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g
5424R microcentrifuge	Eppendorf		or similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes
Flask Incubator Inova S44i	Eppendorf		or similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks
5L glass culture flasks			Baffled glass flasks for culture growth
Bactotryptone	BD	211705	Growth medium
Yeast Extract	Merck	VM930053	Growth medium
Glycerol			Any analytical grade
Glucose			Any analytical grade
KH2PO4			Any analytical grade
K2HPO4			Any analytical grade
UltraPure water	Invitrogen	10977-015	Or output from any MilliQ-type water dispenser