Produção e Otimização de LTE, um Sistema de Expressão de Proteína Livre de Células Derivadas de Leishmania tarentolae para Produção de Proteína Recombinante

Resumo

O Extrato Translacional de Leishmania (LTE) é um sistema de expressão de proteínas livres de células eucarióticas derivado do parasita unicelular, Leishmania tarentolae. Esse protocolo otimizado torna o LTE simples e econômico de fabricar. É adequado para várias aplicações focadas na expressão multiparalela e no estudo de proteínas eucarióticas complexas e suas interações.

Resumo

Este protocolo descreve a produção e otimização de um Sistema de Expressão de Proteína Livre de Células (CFPS) eucariótico derivado do flagelado unicelular Leishmania tarentolae, conhecido como Extrato Translacional de Leishmania ou LTE. Embora este organismo tenha evoluído originalmente como um parasita de lagartixas, ele pode ser cultivado de forma fácil e barata em frascos ou biorreatores. Ao contrário da Leishmania major, não é patogênica para os seres humanos e não requer precauções laboratoriais especiais. Outra vantagem de usar Leishmania para CFPS é que a adição de um único oligonucleotídeo antisense à CFPS, visando uma sequência líder de splice conservada na extremidade 5' de todos os RNAs codificadores de proteínas, pode suprimir a expressão de proteínas endógenas. Fornecemos procedimentos para interrupção celular e processamento de lisados, que foram simplificados e aprimorados em comparação com as versões anteriores. Esses procedimentos começam com culturas de frascos simples. Além disso, explicamos como introduzir informações genéticas usando vetores contendo locais de iniciação de tradução independentes da espécie (SITS) e como realizar otimização direta de lote e controle de qualidade para garantir a qualidade consistente da expressão da proteína.

Introdução

Na década de 1960, os sistemas de expressão de proteínas livres de células desempenharam um papel fundamental na descoberta do código genético¹. No entanto, os sistemas de expressão de proteínas livres de células procarióticas, principalmente baseados em E. coli, atualmente dominam as aplicações laboratoriais e comerciais. Embora os sistemas baseados em E. coli ofereçam vantagens como custo-benefício, escalabilidade e altos rendimentos de expressão, eles enfrentam desafios ao produzir proteínas de múltiplos domínios em suas formas ativas e facilitar a montagem de complexos proteicos

Protocolo

Este protocolo inclui receitas de mídia detalhadas e etapas que envolvem cultura, centrifugação, medição da fluorescência GFP usando um leitor de placas multimodo, medição de cultura OD_600nm e avaliação de lisado Abs_280nm. Também abrange a configuração e a imagem de géis de proteína SDS-PAGE. Os materiais necessários ou sugeridos para este protocolo estão listados na planilha de materiais. É importante observar que os recursos laboratoriais típicos, como componentes de mídia, centrífugas, tubos, espectrofotômetros e configurações de eletroforese em gel, provavelmente podem ser usados de forma intercambiável, a me....

Discussão

Os protocolos para criação de LTE foram publicados na última década⁷ e passaram por atualizações periódicas^25,34. No entanto, os recém-chegados à técnica geralmente encontram uma curva de aprendizado íngreme, resultando em atrasos na obtenção de expressão de proteínas de alta qualidade e alto rendimento. Desafios semelhantes foram relatados por outros grupos de pesquisa que trabalham com LTE.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PD-10 SuperDex 25 Columns	Cytiva	17085101	Gel filtration columns
Nitrogen Cavitation cell disrupter	Parr Industries	4635 or 4639	Cell Disrupter
Bovine derived Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Culture additive
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Antibiotic mix
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Multiwell plate for 10ul expressions
Oligonucleotide	IDT synthesis		Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzyme
Tecan Spark	Tecan		or similar Multimode Platereader
Chemidoc MP Imager	Biorad		or similar SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biophotometer	Eppendorf		or similar Cuvette Specrophotometer
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop spectrophotometer
Avanti JXN-26 centrifuge	Beckman Coulter		or similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g
5424R microcentrifuge	Eppendorf		or similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes
Flask Incubator Inova S44i	Eppendorf		or similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks
5L glass culture flasks			Baffled glass flasks for culture growth
Bactotryptone	BD	211705	Growth medium
Yeast Extract	Merck	VM930053	Growth medium
Glycerol			Any analytical grade
Glucose			Any analytical grade
KH2PO4			Any analytical grade
K2HPO4			Any analytical grade
UltraPure water	Invitrogen	10977-015	Or output from any MilliQ-type water dispenser