Производство и оптимизация LTE, бесклеточной системы экспрессии белка, полученной из Leishmania tarentolae , для производства рекомбинантных белков

Резюме

Leishmania Translational Extract (LTE) представляет собой эукариотическую бесклеточную систему экспрессии белка, полученную из одноклеточного паразита Leishmania tarentolae. Этот оптимизированный протокол делает LTE простым и экономичным в производстве. Он подходит для различных приложений, ориентированных на многопараллельную экспрессию и изучение сложных эукариотических белков и их взаимодействий.

Аннотация

Этот протокол описывает производство и оптимизацию эукариотической системы экспрессии бесклеточных белков (CFPS), полученной из одноклеточного жгутиконосца Leishmania tarentolae, называемого трансляционным экстрактом Leishmania или LTE. Хотя этот организм изначально эволюционировал как паразит гекконов, его можно легко и недорого выращивать в колбах или биореакторах. В отличие от Leishmania major, она непатогенна для человека и не требует специальных лабораторных предосторожностей. Еще одним преимуществом использования Leishmania для CFPS является то, что добавление одного антисмыслового олигонуклеотида к CFPS, нацеленного на консервативную последовательность лидера сплайсинга на 5'-конце всех белок-кодирующих РНК, может подавлять экспрессию эндогенных белков. Мы предоставляем процедуры для разрушения клеток и обработки лизата, которые были упрощены и улучшены по сравнению с предыдущими версиями. Эти процедуры начинаются с простых колбовых культур. Кроме того, мы объясняем, как вводить генетическую информацию с помощью векторов, содержащих видонезависимые сайты инициации трансляции (SITS), и как выполнять прямую оптимизацию партии и контроль качества для обеспечения стабильного качества экспрессии белка.

Введение

В 1960-х годах внеклеточные системы экспрессии белков сыграли ключевую роль в раскрытии генетического^кода. Тем не менее, прокариотические системы экспрессии бесклеточных белков, в основном основанные на E. coli, в настоящее время доминируют как в лабораторных, так и в коммерческих приложениях. В то время как системы на основе E. coli обладают такими преимуществами, как экономическая эффективность, масштабируемость и высокая экспрессия, они сталкиваются с проблемами при производстве многодоменных белков в их активных формах и облегчении сборки белковых^{комплексов2,3<....}

протокол

Этот протокол включает в себя подробные рецепты сред и этапы, которые включают культивирование, центрифугирование, измерение флуоресценции GFP с помощью многорежимного планшетного ридера, измерение наружного диаметра культуры_{600 нм} и оценку лизата Abs_{280 нм}. Он также охватывает настройку и визуализацию белковых гелей SDS-PAGE. Материалы, необходимые или предлагаемые для этого протокола, перечислены в таблице «Материалы». Важно отметить, что типичные лабораторные ресурсы, такие как компоненты среды, центрифуги, пробирки, спектрофотометры и установки для гель-электрофореза, скорее всего, могут использоваться взаимо....

Результаты

Целью экспрессии внеклеточных белков является получение полноразмерных белков в свернутой, активной форме, подходящей для широкого спектра применений. LTE (экстракт Leishmania tarentolae) ранее сравнивали с другими прокариотическими и эукариотическими системами бесклето.......

Обсуждение

Протоколы создания LTE были опубликованы за последнее десятилетие⁷ и претерпели периодические^{обновления25,34}. Тем не менее, новички в этом методе часто сталкиваются с крутой кривой обучения, что приводит к задержкам в достиже.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PD-10 SuperDex 25 Columns	Cytiva	17085101	Gel filtration columns
Nitrogen Cavitation cell disrupter	Parr Industries	4635 or 4639	Cell Disrupter
Bovine derived Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Culture additive
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Antibiotic mix
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Multiwell plate for 10ul expressions
Oligonucleotide	IDT synthesis		Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzyme
Tecan Spark	Tecan		or similar Multimode Platereader
Chemidoc MP Imager	Biorad		or similar SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biophotometer	Eppendorf		or similar Cuvette Specrophotometer
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop spectrophotometer
Avanti JXN-26 centrifuge	Beckman Coulter		or similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g
5424R microcentrifuge	Eppendorf		or similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes
Flask Incubator Inova S44i	Eppendorf		or similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks
5L glass culture flasks			Baffled glass flasks for culture growth
Bactotryptone	BD	211705	Growth medium
Yeast Extract	Merck	VM930053	Growth medium
Glycerol			Any analytical grade
Glucose			Any analytical grade
KH2PO4			Any analytical grade
K2HPO4			Any analytical grade
UltraPure water	Invitrogen	10977-015	Or output from any MilliQ-type water dispenser