재조합 단백질 생산을 위한 Leishmania tarentolae 유래 Cell-Free 단백질 발현 시스템인 LTE의 생산 및 최적화

요약

Leishmania Translational Extract(LTE)는 단세포 기생충인 Leishmania tarentolae에서 유래한 진핵 세포 없는 단백질 발현 시스템입니다. 이 최적화된 프로토콜은 LTE를 간단하고 비용 효율적으로 제조할 수 있도록 합니다. 복잡한 진핵생물 단백질의 다병렬 발현 및 연구와 그 상호 작용에 초점을 맞춘 다양한 응용 분야에 적합합니다.

초록

이 프로토콜은 Leishmania Translational Extract 또는 LTE라고 하는 단세포 편모 Leishmania tarentolae에서 유래한 진핵생물 Cell-Free Protein Expression System(CFPS)의 생산 및 최적화를 간략하게 설명합니다. 이 유기체는 원래 도마뱀붙이의 기생충으로 진화했지만 플라스크나 생물 반응기에서 쉽고 저렴하게 배양할 수 있습니다. Leishmania major와 달리 인간에게 비병원성이며 특별한 실험실 예방 조치가 필요하지 않습니다. CFPS에 Leishmania를 사용하는 또 다른 이점은 모든 단백질 코딩 RNA의 5'-말단에서 보존된 스플라이스 리더 서열을 표적으로 하는 CFPS에 단일 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가하면 내인성 단백질 발현을 억제할 수 있다는 것입니다. 당사는 세포 파괴 및 용해물 처리를 위한 절차를 제공하며, 이는 이전 버전에 비해 단순화되고 개선되었습니다. 이러한 절차는 간단한 플라스크 배양으로 시작합니다. 또한 종 독립적 번역 시작 사이트(SITS)를 포함하는 벡터를 사용하여 유전 정보를 도입하는 방법과 일관된 단백질 발현 품질을 보장하기 위해 간단한 배치 최적화 및 품질 관리를 수행하는 방법을 설명합니다.

서문

1960년대에는 cell-free 단백질 발현 시스템이 유전 코드¹을 밝히는 데 중추적인 역할을 했습니다. 그러나 주로 대장균을 기반으로 하는 원핵 세포 무료 단백질 발현 시스템은 현재 실험실 및 상업 응용 분야를 지배하고 있습니다. 대장균 기반 시스템은 비용 효율성, 확장성 및 높은 발현 수율과 같은 이점을 제공하지만, 활성 형태의 다중 영역 단백질을 생산하고 단백질 복합체 ^2,3의 조립을 촉진할 때 문제에 직면합니다. 오늘날 일반적으로 사용되는 진핵생물 무세포 단백질 합성(CFPS) 형태에는 밀 배아 추출물(WGE), 토끼 망상적혈구 용해물(RRL) 및 곤충 세포 용해물(ICL)이 포함됩니다.^4,5,6. 이 연구는 단세포 편모충 기생충 Leishmania tarentolae를 기반으로 하는 간단하고 확장 가능한 대체 진핵 세포 없는 시스템을 소개합니다.

프로토콜

이 프로토콜에는 배양, 원심분리, 멀티모드 플레이트리더를 사용한 GFP 형광 측정, 배양 OD_600nm 측정 및 용해물 Abs_280nm 평가와 관련된 자세한 배지 레시피 및 단계가 포함되어 있습니다. 또한 SDS-PAGE 단백질 겔의 설정 및 이미징도 다룹니다. 이 프로토콜에 필요하거나 제안된 재료는 재료 스프레드시트에 나열되어 있습니다. 매체 구성 요소, 원심분리기, 튜브, 분광 광도계 및 겔 전기영동 설정과 같은 일반적인 실험실 리소스는 달리 명시되지 않는 한 상호 교환하여 사용할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그림 1 은 LTE 제조 공정을 요약한 것입니다.

그림 1: LTE 제조 프로토콜 개요. ....

토론

LTE를 생성하기 위한 프로토콜은 지난 10년 동안 발표되었으며⁷ 주기적인 업데이트를 거쳤습니다^25,34. 그러나 이 기술을 처음 접하는 사람들은 종종 가파른 학습 곡선에 직면하여 고품질 및 고수율 단백질 발현을 달성하는 데 지연이 발생합니다. LTE³⁵를 사용하는 다른 연구 그룹에서도 유사한 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PD-10 SuperDex 25 Columns	Cytiva	17085101	Gel filtration columns
Nitrogen Cavitation cell disrupter	Parr Industries	4635 or 4639	Cell Disrupter
Bovine derived Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Culture additive
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Antibiotic mix
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Multiwell plate for 10ul expressions
Oligonucleotide	IDT synthesis		Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzyme
Tecan Spark	Tecan		or similar Multimode Platereader
Chemidoc MP Imager	Biorad		or similar SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biophotometer	Eppendorf		or similar Cuvette Specrophotometer
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop spectrophotometer
Avanti JXN-26 centrifuge	Beckman Coulter		or similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g
5424R microcentrifuge	Eppendorf		or similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes
Flask Incubator Inova S44i	Eppendorf		or similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks
5L glass culture flasks			Baffled glass flasks for culture growth
Bactotryptone	BD	211705	Growth medium
Yeast Extract	Merck	VM930053	Growth medium
Glycerol			Any analytical grade
Glucose			Any analytical grade
KH2PO4			Any analytical grade
K2HPO4			Any analytical grade
UltraPure water	Invitrogen	10977-015	Or output from any MilliQ-type water dispenser